亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細胞及其抗氧化酶活力的影響

冼健安， 張秀霞， 郭 慧， 王冬梅， 王安利

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101；2華南師范大學生命科學學院，廣東省水產健康安全養殖重點實驗室，生態與環境科學廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510631；3廣東海洋大學水產學院，南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025

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亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細胞及其抗氧化酶活力的影響

冼健安1，2， 張秀霞1， 郭 慧3， 王冬梅1， 王安利2*

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101；2華南師范大學生命科學學院，廣東省水產健康安全養殖重點實驗室，生態與環境科學廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510631；3廣東海洋大學水產學院，南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025

【背景】亞硝酸鹽是蝦類集約化養殖過程中最常見的毒性污染物之一，研究亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細胞的毒性以及抗氧化酶在抗脅迫防御中的作用，能夠為羅氏沼蝦養殖過程中的亞硝酸鹽中毒防治提供理論參考?！痉椒ā恳圆煌瑵舛?0、1、5和10 mg·L-1)的亞硝態氮(NO2--N)對羅氏沼蝦進行脅迫，于脅迫后的0、6、12、24和48 h取樣，應用流式細胞術檢測血細胞活性氧(ROS)含量和細胞凋亡率，同時測定血細胞總數(THC)和胞內抗氧化酶活力?！窘Y果】1 mg·L-1NO2--N在48 h內對血細胞ROS含量、凋亡率和THC均無顯著影響。5 mg·L-1NO2--N脅迫24 h，血細胞ROS含量顯著上升，THC顯著下降，脅迫48 h凋亡率顯著提高。10 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，血細胞ROS含量和凋亡率均顯著上升，脅迫12 h THC顯著下降。血細胞的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活力均不同程度地被NO2--N脅迫所誘導，CAT活力主要在脅迫前期提高，而GPx活力在脅迫后期提高?！窘Y論與意義】亞硝酸鹽存在濃度和時間毒性效應，一定濃度的亞硝酸鹽會誘導蝦血細胞產生ROS，這些ROS的過量產生誘導了血細胞發生凋亡，繼而導致THC下降，這一氧化脅迫過程可能是亞硝酸鹽對羅氏沼蝦產生細胞毒性的重要機制之一?？寡趸富盍Φ恼T導表明抗氧化酶在亞硝酸鹽脅迫過程中發揮防御作用。

亞硝酸鹽； 羅氏沼蝦； 血細胞； 氧化脅迫； 抗氧化活力

水產動物主要以氨氮的形式排泄氮廢物，在亞硝化細菌的作用下，氨氮會轉變為毒性更強的亞硝酸鹽。隨著養殖周期的延長，水環境中的亞硝酸鹽濃度也相應增高(寇紅巖等,2014)。亞硝酸鹽是水產養殖過程中最常見的環境毒性因子之一，尤其對現代的集約化高密度養殖影響更大。亞硝酸鹽對蝦類的毒性影響主要集中在半致死濃度、組織結構、生理生化代謝和免疫酶活性的影響等方面(胡賢德等,2009; 胡義波等,2005; 黃翔鵠等,2006; 呂曉燕等,2010； 彭自然等,2004; Tseng & Chen,2004; Wangetal.,2004)。研究顯示，水體中較高含量的亞硝酸鹽會趨向于在蝦的血淋巴中積累(寇紅巖等,2014； Chenetal.,1992)。因此，亞硝酸鹽脅迫對蝦血細胞會產生直接影響，但目前針對亞硝酸鹽對蝦類血細胞毒性影響的研究甚少。Xianetal. (2011)的研究表明，亞硝酸鹽脅迫會對斑節對蝦Penaeusmonodon(Fabricius)的血細胞產生氧化脅迫作用，從而誘導血細胞凋亡，并導致血細胞總數(total haemocyte count，THC)下降，因而推測亞硝酸鹽脅迫對淡水蝦類可能也具有相同的細胞毒性機制。因此,本研究以羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii(de Man)為研究對象，分析亞硝酸鹽對淡水蝦類血細胞的影響；另外，為探討蝦血細胞如何通過調節抗氧化活力進行抗亞硝酸鹽防御，本研究還測定了血細胞中3類主要抗氧化酶活力的變化，以期為羅氏沼蝦養殖過程中的亞硝酸鹽脅迫防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅氏沼蝦購于廣東省廣州市黃沙水產交易市場，室內[pH 7.9～8.0，溫度(24±2)℃，不間斷曝氣]馴養，每天7:00和17:00投喂商業羅氏沼蝦成蝦餌料(粗蛋白30%，粗脂肪3%)2次，試驗前停食1 d。馴養1周后，選取附肢完整、無病患、活力強的個體作為試驗用蝦，平均體重(11.16±1.34) g。

1.2 亞硝酸鹽脅迫

以NaNO2作為亞硝酸氮源，設置3個NO2--N脅迫濃度：1、5和10 mg·L-1，不添加組為對照組，每組3個平行。每個養殖桶(直徑65 cm的圓形塑料桶)放水180 L，每桶放養羅氏沼蝦35尾。試驗水源為經曝氣1周的自來水，未測出亞硝酸氮，其他水體條件與馴養時的條件一致，脅迫試驗期間不投餌，為保證試驗期間的亞硝酸氮濃度，每24 h換取相應NO2--N濃度的水一次，換水量為50%。在脅迫的0、6、12、24和48 h取樣測定。

1.3 血細胞指標測定

1.3.1 血細胞懸液的制備與血細胞總數測定 用2.5 mL的一次性注射器吸取400 μL預冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g·L-1，檸檬酸鈉8 g·L-1，氯化鈉4.2 g·L-1，pH 7.5)，從蝦的圍心腔抽取等量血淋巴，將血淋巴轉移到離心管中，取20 μL到血細胞計數板中，用光學顯微鏡觀察計數測定THC；剩余血淋巴用預冷的抗凝劑調整細胞濃度至1×106個·mL-1，制備的血細胞懸液用于流式細胞術指標的測定。

1.3.2 流式細胞儀 所用流式細胞儀為美國BD公司的FACSCalibur，應用CellQuest軟件(Becton Dickinson Immuno-cytometry Systems, San Jose, CA)進行試驗數據的獲取和分析。用綠色熒光通道(第一熒光通道，FL1)獲取DCF和FITC的熒光數據，用橙黃色熒光通道(第二熒光通道，FL2)獲取PI的熒光數據。每個樣品均獲取細胞數10000個。

1.3.3 血細胞活性氧含量 以DCFH-DA為熒光標記探針測定血細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。分別取血細胞懸液200 μL，加入10 μmol·L-1DCFH-DA避光孵育30 min，經200目篩網過濾后，上流式細胞儀檢測。結果以DCF熒光強度為橫坐標、細胞數量為縱坐標的單參數直方圖顯示，分析細胞的DCF平均熒光強度，胞內的ROS含量與DCF平均熒光強度成正比(冼健安等,2012a)。

1.3.4 血細胞凋亡率 以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定血細胞凋亡率。血細胞懸液進行離心，血細胞重懸于1×Annexin V結合緩沖液中，使細胞濃度約為3×106個·mL-1，每100 μL血細胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后，加入400 μL 1×Annexin V結合緩沖液，200目篩網過濾后立即上流式細胞儀檢測。以Annexin V-FITC熒光強度為橫坐標，PI熒光強度為縱坐標作雙參數散點圖，設十字門劃分細胞類群：活細胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于左下象限，前期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于右下象限，后期凋亡細胞和死細胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于右上象限。分析各類細胞的比例，凋亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細胞所占的比例，即右下象限和右上象限細胞所占的比例(冼健安等,2012b)。

1.4 胞內抗氧化酶活力測定

1.4.1 血細胞勻漿液的制備 如上述所取蝦的血淋巴在4 ℃下以3000 r·min-1離心10 min，棄上清，以等量生理鹽水重懸血細胞，在冰浴中進行超聲波破碎(勻漿3 s，間歇8 s，次數10次)，再將勻漿液離心(4 ℃、3000 r·min-1，10 min)，上清液為待測液。

1.4.2 酶活力測定 采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒分別測定SOD、CAT和GPx活力。按照說明書步驟進行操作并計算酶活力。

1.5 統計分析

試驗數據利用SPSS 13.0進行單因素方差分析，結果顯示為平均值±標準差(Mean±SD)，P<0.05確認為差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 血細胞總數

羅氏沼蝦的初始THC為(36.41±3.48)×105個·mL-1。在試驗的48 h內，1 mg·L-1NO2--N脅迫對羅氏沼蝦的THC無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫24和48 h，10 mg·L-1NO2--N脅迫12、24和48 h，THC均顯著下降(P<0.05)。脅迫48 h，5和10 mg·L-1的THC分別下降至(27.49±1.51)×105和(25.70±2.68)×105個·mL-1(圖1)。

圖1 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞總數

2.2 血細胞活性氧含量

在試驗的48 h內，1 mg·L-1NO2--N脅迫對羅氏沼蝦的ROS無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫24和48 h，10 mg·L-1NO2--N脅迫6、12、24和48 h，蝦血細胞ROS含量顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 血細胞凋亡率

羅氏沼蝦的初始血細胞凋亡率為0.95%。在48 h內，1 mg·L-1NO2--N脅迫對血細胞凋亡率無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫48 h，血細胞凋亡率顯著升高至3.36%(P<0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，血細胞凋亡率開始顯著提高(P<0.05)，在24 h達到最高值，為6.75%(圖3)。

圖2 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞活性氧含量

圖3 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞凋亡率

2.4 血細胞SOD活力

如圖4所示，1、5 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，SOD活力顯著提高(P<0.05)，隨后恢復至對照組水平(P>0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫時，SOD活力在脅迫的12和24 h有顯著提高(P<0.05)，隨后下降至對照組水平(P>0.05)。

2.5 血細胞CAT活力

圖5所示，1 mg·L-1NO2--N脅迫12 h，5 mg·L-1NO2--N脅迫24 h，CAT活力呈現顯著上升(P<0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫時，CAT活力在脅迫的6、12和24 h均顯著高于對照組(P<0.05)，在48 h時下降至對照組水平(P>0.05)。

2.6 血細胞GPx活力

如圖6所示，在脅迫的6 h時，各脅迫組的GPx活力與對照組之間均無顯著差異(P>0.05)。經1 mg·L-1NO2--N脅迫后，GPx活力在48 h呈現顯著上升(P<0.05)；5 mg·L-1脅迫組的GPx活力在24和48 h顯著上升(P<0.05)；10 mg·L-1脅迫組的GPx活力在12和24 h顯著上升(P<0.05)，在48 h下降至對照組水平(P>0.05)。

圖4 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞SOD活力

圖5 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞CAT活力

圖6 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細胞GPx活力

3 討論

3.1 亞硝酸鹽對血細胞的影響

蝦類為無脊椎動物，一般被認為僅具先天性免疫，血細胞在其生理和免疫過程中起著十分重要的作用(Johanssonetal.,2000)。蝦類的循環血細胞數量，即THC，對外界環境十分敏感。研究顯示，各類環境因子脅迫，如氨氮(Rodríguez-Ramosetal.,2008)、亞硝酸鹽(Tseng & Chen,2004; Wangetal.,2004)、重金屬(Lorenzonetal.,2001)、硫化物(Chengetal.,2007)和鹽度(Wang & Chen,2006)等，均會導致THC下降，從而使蝦的免疫力下降。當外界亞硝酸鹽含量較高時，亞硝酸鹽趨向于進入蝦血淋巴中并積累(寇紅巖等,2014； Chen & Chen,1992; Chengetal.,2007)，此時亞硝酸鹽直接接觸并作用于血細胞，因此應重視亞硝酸鹽的血細胞毒性影響研究。關于亞硝酸鹽如何導致THC下降，Xianetal.(2011)借助FCM在斑節對蝦上做了初步研究。本研究以淡水蝦羅氏沼蝦為研究對象，也得到了相似的結果，表明亞硝酸鹽對淡水蝦類的血細胞也具有相同的氧化脅迫毒性機制。另外，研究還發現，亞硝酸鹽對羅氏沼蝦血細胞的毒性影響具有明顯的濃度和時間效應。當NO2--N濃度為1 mg·L-1時，在試驗的48 h內，并未發現對細胞指標有顯著的影響；濃度為5 mg·L-1時，細胞指標在脅迫后期出現顯著的變化；而濃度為10 mg·L-1時，細胞指標在前期即發生顯著變化。

一般認為，由于Cl-與NO2-會競爭鰓上的吸收位點，鹽度越高，Cl-的含量就越高,競爭吸收進入蝦體內的NO2-就越少，因此水體鹽度越高，蝦對亞硝酸鹽的耐受能力越強(胡賢德等,2009)，因而海水蝦類的亞硝酸鹽耐受能力普遍高于淡水蝦類(寇紅巖等,2014)。這在血細胞指標的變化上也有一定的體現，在斑節對蝦的研究中，NO2--N濃度達到10 mg·L-1時，血細胞指標的顯著變化也僅在脅迫后期才開始發生；濃度達到20 mg·L-1時，血細胞指標在前期即開始有顯著變化(Xianetal.,2011)。相比較之下，羅氏沼蝦血細胞對外界亞硝酸鹽濃度更為敏感，耐受能力較斑節對蝦低。為使羅氏沼蝦的脅迫響應更為顯著，根據預試驗結果，本研究選定了較高的亞硝酸氮濃度。試驗過程中發現，經5和10 mg·L-1脅迫24 h，羅氏沼蝦的活動變得遲鈍緩慢，但48 h試驗過程中未出現死亡個體。

3.2 亞硝酸鹽對抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶是機體內清除過量ROS的重要工具，在正常生理狀態下，ROS的產生和清除在抗氧化酶以及其他抗氧化物質的作用下處于良好的動態平衡中；當機體受到環境脅迫時，這種動態平衡往往會被打破，機體容易受到氧化損傷，此時抗氧化酶活力的調動是機體進行抗氧化防御的重要手段。研究顯示，環境脅迫如溫度、pH、氨氮等會誘導蝦類抗氧化酶基因表達水平或酶活力提高，以進行抗氧化防御(蔣琦辰等,2013； Wangetal.,2009; Zhouetal.,2010)；但當環境脅迫程度較高或脅迫時間延長時，抗氧化系統不足以控制ROS的過量產生，細胞便會受到氧化損傷，導致抗氧化體系反而受到破壞，抗氧化酶轉錄水平或酶活力會呈現出被抑制的狀態(劉曉華等,2007; 王玥等,2005; Wangetal.,2009)。在較多的亞硝酸鹽脅迫研究中，不論以肝胰腺、鰓、血清還是以肌肉為研究對象，往往都表現出對抗氧化酶活力的抑制性(黃翔鵠等,2006; 呂曉燕等,2010； 王玥等,2005)，這與脅迫濃度和時間有一定關系，另外可能由于亞硝酸鹽自身也具有強氧化性，相比溫度、pH等環境因子，對抗氧化酶具有更強的破壞性。當凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei(Boone)受亞硝酸鹽脅迫時，其血細胞中的Mn-SOD、CAT、GPx和硫氧還蛋白的轉錄水平均被不同程度地誘導提高(Guoetal.，2013)。本研究中，為了探討血細胞對亞硝酸鹽脅迫作出的胞內抗氧化響應，測定了血細胞胞內的抗氧化酶活力。結果顯示，胞內的SOD、CAT和GPx活力均不同程度地升高，與凡納濱對蝦的表達量研究結果相似，表明血細胞調動了胞內的抗氧化酶體系以對抗亞硝酸鹽脅迫帶來的氧化威脅。

如本試驗所述，在1 mg·L-1最低濃度脅迫時，THC、ROS含量和凋亡率均未發生顯著變化，但3類抗氧化酶的活力卻有一定程度的提高，表明在此亞硝酸鹽濃度下，血細胞通過調動胞內的抗氧化酶體系，維持了胞內的氧化與抗氧化動態平衡，保護血細胞免受損傷，因此在THC等細胞指標上沒有體現出脅迫響應變化。隨著亞硝酸鹽濃度的提高，雖然抗氧化酶活力也被誘導提高，但細胞指標也出現了顯著的負面變化，表明此時被激活提高的抗氧化酶體系不足以對抗高濃度亞硝酸鹽造成的氧化脅迫，導致血細胞受到氧化損傷。

CAT和GPx均是清除H2O2的抗氧化酶。在本研究中，CAT和GPx活力的變化體現了一定的時間效應，CAT活力主要在脅迫前期被誘導提高，而GPx活力的提高主要出現在脅迫后期。這些結果表明，CAT和GPx具有協同作用，在亞硝酸鹽脅迫時，羅氏沼蝦血細胞優先調動了CAT進行H2O2的清除，而隨著脅迫時間的延長，GPx成為清除H2O2的主力。關于CAT和GPx的協同作用，在其他一些環境因子脅迫過程中也有相似的體現(Wangetal.,2009; Zhouetal.,2010)。

本研究結果顯示了抗氧化酶在抗亞硝酸鹽脅迫過程中扮演著重要角色。營養學研究表明，在飼料中添加適量的營養素或添加劑可提高水產動物的抗氧化活力，尤其是銅、錳等與抗氧化酶組成相關的礦物元素(郭志勛等,2003; 王宏偉等,2008)，以及維生素C、E等自身具有抗氧化能力的物質(秦志華等,2007; 周立斌等,2009)。因此，在飼料中添加適量的這些營養素或添加劑可能有助于提高蝦類的抗亞硝酸鹽脅迫能力，這在一些初步的研究中已有體現(冼健安等,2013)，更廣泛的證據還有待進一步研究。通過營養學角度提高蝦類的抗亞硝酸鹽脅迫能力，可更安全、便捷地降低養殖風險、減少用藥，是發展可持續生態養殖的理想途徑。

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(責任編輯:郭瑩)

Effects of nitrite on haemocyte and antioxidant enzyme activity inMacrobrachiumrosenbergii

Jian-an XIAN1,2, Xiu-xia ZHANG1, Hui GUO3, Dong-mei WANG1, An-li WANG2*

1InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou,Hainan571101,China;2KeyLaboratoryofEcologyandEnvironmentalScienceofGuangdongHigherEducationInstitutes,GuangdongProvincialKeyLaboratoryforHealthyandSafeAquaculture,SchoolofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou,Guangdong510631,China;3KeyLaboratoryofAquacultureinSouthChinaSeaforAquaticEconomicAnimalofGuangdongHigherEducationInstitutes,CollegeofFisheries,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang,Guangdong524025,China

【Background】 Nitrite is one of the most common pollutants in intensive shrimp aquaculture. In order to provide theoretical basis of nitrite prevention and cure for culture ofMacrobrachiumrosenbergii, we investigated the toxicity effects of nitrite onM.rosenbergiihaemocytes, and the role of antioxidant enzymes in anti-nitrite defense. 【Method】 Prawns were exposed to different doses (0, 1, 5 and 10 mg·L-1) of NO2--N. Reactive oxygen species (ROS) production in haemocytes and apoptotic haemocyte ratio were determined by flow cytometry. The total haemocyte count (THC) and intracellular antioxidant enzyme activities were also analysed after 0, 6, 12, 24 and 48 h exposure. 【Result】 Results showed that 1 mg·L-1NO2--N had no significant effect on ROS production, apoptotic cell ratio and THC. Increase of ROS production and decline of THC could be observed in prawn exposed to 5 mg·L-1NO2--N after 24 h, and increase of apoptotic ratio occurred after 48 h. Increase of both ROS production and apoptotic ratio were observed in prawn exposed to 10 mg·L-1NO2--N after 6 h, and THC decreased after 12 h. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathion peroxidase (GPx) activities in haemocytes were induced by NO2--N to different levels. 【Conclusion and significance】 These results clearly demonstrate the dose- and time-dependent toxic effect of nitrite. They also indicate that nitrite could induce the ROS generation in prawn haemocytes and then the overproduction of ROS causeing haemocyte apoptosis and subsequent THC decline. This process of oxidative stress is one of the cytotoxicity mechanisms of nitrite onM.rosenbergii. The induced activities of antioxidant enzymes indicate that these antioxidant enzymes play a vital role in anti-nitrite defence.

nitrite;Macrobrachiumrosenbergii; haemocyte; oxidative stress; antioxidant activity

2016-04-25 接受日期(Accepted)： 2016-05-30

廣東省自然科學基金(2015A030310438、S2012040008093)

冼健安， 男， 助理研究員, 博士。 研究方向: 水產養殖生態及毒理學。 E-mail: xian-ja@163.com

*通訊作者(Author for correspondence), E-mail: wanganl@scnu.edu.cn

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.04.012