馬拉硫磷和百菌清脅迫下斑馬魚行為變化的研究

逯南南，李汝，宋武昌，孫韶華，賈瑞寶,*

1.山東省城市供排水水質監測中心，濟南250021

2.山東建筑大學，濟南250101

馬拉硫磷和百菌清脅迫下斑馬魚行為變化的研究

逯南南1，李汝2，宋武昌1，孫韶華1，賈瑞寶1,*

1.山東省城市供排水水質監測中心，濟南250021

2.山東建筑大學，濟南250101

以馬拉硫磷和百菌清為脅迫因子,本文研究了2種污染物暴露下斑馬魚行為強度的變化。首先通過急性毒性試驗確定了2種農藥對斑馬魚24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度(LC50),其次以LC50-48h為1個染毒單位(TU),在0.01 TU、0.1 TU、0.5 TU、1 TU、2 TU 5個條件下,本文開展了斑馬魚行為學研究。結果顯示,48 h馬拉硫磷暴露斑馬魚的LC50為5mg·L-1,百菌清暴露斑馬魚的LC50為0.01mg·L-1。隨著污染物濃度增大,綜合行為強度變化幅度增大。在設置的暴露濃度下,斑馬魚的行為強度在急劇增大或減小后都出現了明顯的調節適應過程,基本符合環境壓力模型。通過比較在不同頻率下的影響強度,馬拉硫磷和百菌清暴露斑馬魚擺鰭所受影響最大。本研究提示,水質監測中可增加斑馬魚擺鰭觀察指標。

馬拉硫磷；百菌清；斑馬魚；行為變化

近年來水體污染日益嚴重,水污染事件頻發。經調查,農業生產過程中使用的肥料和農藥等,是造成水域面源污染的重要因素[1-2]。馬拉硫磷和百菌清是農業生產中常見的兩種農藥,其中馬拉硫磷為一種高選擇毒性的有機磷農藥,在世界范圍內應用廣泛,水體中的檢出率較高[3]。百菌清是一種非內吸性廣譜殺菌劑,廣泛用于蔬菜、果樹、豆類、水稻、小麥等多種作物病害的防治。由于其普遍性、高生物毒性和難降解性,水體中馬拉硫磷和百菌清的監測及其對生物體的毒性研究越來越受到重視。

魚類在水環境中的行為特征可以反映水體健康狀況,當水環境發生變化時,魚類對環境的適應性最先表現為行為改變[4],行為變化已作為描述污染物脅迫的一項重要綜合生物指標用于水質監測[5]?；隰~的呼吸行為和運動行為監測的水質預警技術在國內外已有大量研究[6,7],廣泛應用于水源地、河流、污水處理廠等水質的監測。本研究以馬拉硫磷和百菌清為脅迫因子,研究農藥類污染物脅迫下斑馬魚的行為響應機制,為農藥類突發污染的在線監測提供技術支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 供試生物

斑馬魚,購于濟南某花鳥魚蟲市場,經實驗室馴養2周后用于試驗,體長3～4 cm,體重(0.3±0.1)g。馴養條件:置于水溫為(25±2)℃,連續曝氣的自來水中,光照:黑暗=12 h:12 h,每天并喂食1次,以5 min內魚食吃完為宜,試驗前24 h及試驗過程中不喂食。整個馴養期間死亡率＜10%,方可用于試驗。

1.1.2 試驗儀器

水質安全在線生物預警系統BEWs-03(中國科學院生態環境研究中心)。

1.1.3 試劑

84%馬拉硫磷EC乳油、75%百菌清可濕性粉劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性試驗

參照《水質物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》(GB/T13267-91)要求操作[8]。

1.2.2 行為學監測

以急性毒性試驗結果為依據,48 h半致死率(LC50-48h)設定為1個染毒單位(1 TU),每種農藥設定0.01 TU、0.1 TU、0.5 TU、1 TU、2 TU 5個濃度進行試驗。試驗采用流水式試驗,流速2 L·h-1,每個通道放置2條斑馬魚,生物綜合行為強度[9]為判定指標,研究不同污染物濃度下斑馬魚的行為變化。

1.2.3 數據分析

首先對不同頻率下斑馬魚行為變化研究中對試驗測定數據做如下修正:

其中0.5 hz、1.0 hz、1.5 hz、5.0 hz 4個頻率i的取值分別為1、2、3、4；Ii表示不同頻率下斑馬魚行為強度值的修正值；I0i表示不同頻率下斑馬魚行為強度測定值。數據分析利用SPSS20軟件完成,使用修正后的數值進行多重比較(Duncan法)。

2 結果(Results)

2.1 急性毒性試驗

在試驗中觀察到隨著馬拉硫磷濃度增大,魚鰓、腹部出現紅色出血癥狀,魚體出現側游、漩游、翻滾、仰翻、沉底失去平衡等中毒癥狀,伴隨作用時間延長運動能力下降,躺臥死亡。而在百菌清暴露下魚體活躍度很高,四處亂竄,魚體仰翻,鰓絲發紅,身體彎曲,漂浮水面死亡。該現象與吳聲敢、趙于丁等[10-12]學者的研究結果相似。

利用統計軟件SPSS20進行Probit模型線性回歸,計算得出各個作用時間下污染物對斑馬魚的半致死率LC50如表1所示,馬拉硫磷和百菌清暴露下斑馬魚 LC50-48h分別為4.867mg·L-1和0.009mg·L-1,定義5mg·L-1和0.01mg·L-1為2種農藥的1個染毒單位。根據現行的《化學農藥環境安全評價試驗準則》中提出農藥類物質對魚類毒性的分級標準(LC50-48h)[13-14],馬拉硫磷和百菌清對斑馬魚屬于中毒和劇毒物質；而根據國家環保部發布的《新化學物質危害評估導則》對魚類急性毒性的分級標準(LC50-96h)[15],馬拉硫磷和百菌清對斑馬魚屬于高毒和劇毒物質。按照常規的計算方法安全濃度(SC=0.1×LC50-96h)2種物質對斑馬魚的SC分別為0.432mg·L-1和0.0006mg·L-1,均低于地表水環境質量標準限值。

表1 馬拉硫磷和百菌清對斑馬魚的急性毒性試驗結果Table 1 Acute toxicities of malathion and chlorothalonil to zebrafish

2.2 行為強度變化研究

馬拉硫磷和百菌清2種農藥暴露下斑馬魚的行為強度變化如圖1所示,可以看出對照組(即污染物濃度為0)魚的行為強度在0.6左右上下浮動,基本保持穩定,可以用于污染物的暴露試驗。兩種污染物暴露下,隨著污染物濃度的增大和暴露時間的延長,斑馬魚的行為強度呈現下降的趨勢。2種農藥0.01 TU濃度暴露斑馬魚的行為強度與對照組相比沒有明顯的變化,0.1 TU、0.5 TU、1 TU的暴露濃度下,斑馬魚的行為經歷了刺激、調整、適應再降低過程,符合劉勇等[16]建立的污染物脅迫下的日本青鳉逐級行為模型；而在高濃度(2 TU)暴露中,斑馬魚的行為強度在經歷一個逐漸降低過程以后,逐漸趨于0。在此過程中也存在明顯的行為調節,其中馬拉硫磷試驗組出現在暴露6 h以后,百菌清組則是出現在暴露10 h以后。

圖1 馬拉硫磷和百菌清對斑馬魚行為強度的影響(A:馬拉硫磷，B:百菌清)Fig.1 Effects of malathion and chlorothalonil on the behavior strength of zebrafish(A:malathion,B:chlorothalonil)

2.3 不同頻率下行為強度的研究

據水質安全在線生物預警系統(BEWs)配套資料可知,該系統能夠監測0.5 hz、1.0 hz、1.5 hz、5.0 hz 4個頻率下的斑馬魚行為強度變化,分別表示斑馬魚的游動、擺動、攝食、擺鰭4種運動行為。我們以1 TU濃度暴露試驗為例分析了2種農藥對斑馬魚不同行為指標的影響。斑馬魚不同頻率下相對行為強度變化多重比較結果表明,馬拉硫磷暴露對斑馬魚行為影響程度大小排序為擺鰭＞攝食＞游動＞擺動,而百菌清暴露下為擺鰭＞攝食＞擺動＞游動,擺鰭與游動、擺動、攝食三者之間均有顯著性差異,而游動、擺動、攝食之間無顯著性差異。2種污染物暴露均對魚體擺鰭行為影響最大,可能因為同為農藥類污染物,對斑馬魚毒性作用機制相似。

圖2 不同行為指標多重比較結果注:a、b為兩個不同的區間,影響程度a＞b,不同區間內的項目差異顯著,同一區間內的項目無顯著性差異。Fig.2 The results of multiple comparison with behavioral indicatorsNote:“a”and“b”for two different interval,order of influence:a＞b, significant difference was found between different interval and no significant difference was found in the same interval.

3 討論(Discussion)

Gerhardt等[17]研究證明在一定的水體環境下,利用不同頻率信號記錄的生物的游動、爬行、行走和呼吸等運動行為參數都在一個穩定范圍內變化。本研究中對照試驗組斑馬魚的綜合行為強度保持基本穩定,為后續的污染物暴露提供了可靠的參照。魚體對化學刺激品有敏銳的感受器官,它不僅能感覺到環境的改變,還能對這些變化做出回避、咳嗽等多種行為回應[18]。根據環境壓力模型,生物體受到外界刺激時,其行為強度主要經歷刺激、適應、調整、甚至再調整,直至產生明顯行為毒性效應的過程[19]。趙曉燕等[20]研究了抗生素和有機磷農藥暴露下斑馬魚行為強度的變化,發現隨著藥物濃度的增加,斑馬魚行為變化的強度增大,響應時間縮短,且行為強度的變化符合環境壓力模型；劉勇等[16]研究了有機磷農藥暴露下日本青鳉魚的行為響應,構建了污染物聯合脅迫下的逐級行為模型。本研究發現2種農藥暴露下,污染物濃度越大,綜合性為強度的變化幅度越大,表明污染物的毒性在增加。在設置的暴露濃度下,斑馬魚的行為強度在急劇增大或減小后都出現了明顯的調節適應過程,“適應期”內魚體通過對自身行為和生理機能的調節,逐步適應了外界環境的壓力,整個暴露期內魚體行為強度的變化基本符合環境壓力模型,與前人的研究結果一致。

大量的研究表明農藥類污染物對水生生物存在毒性效應[21-23],可通過呼吸、食物鏈和體表3個途徑進入生物體內,對水生生物的糖類、蛋白質、脂質等3大類的代謝產生影響,影響魚類行為和生理效應[22]。馬拉硫磷作為一種有機磷殺蟲劑,是乙酰膽堿酯酶的神經毒劑,主要通過馬拉硫磷活化代謝產物來實現對膽堿酯酶的抑制[24],導致乙酰膽堿過量蓄積,造成體表分泌黏液,肝臟顏色變淡,顱腔充血以及行為學的改變。百菌清對斑馬魚的毒性機制可能為影響魚腦中酪氨酸轉氨酶(TAT)的表達調控,進而影響機體糖代謝水平,造成體內ATP水平降低,魚體活性減弱[25]。

由于魚體的行為變化要提前于生理損傷或死亡,能夠在第一時間實現在水體中污染物的監測預警,對2種農藥暴露下斑馬魚不同頻率的行為強度研究發現,2種農藥均對斑馬魚的擺鰭行為影響最為顯著,建議在進行綜合行為強度監測的基礎上增加魚體擺鰭行為的監測,進一步提高生物監測的準確性和可靠性。在后續的研究中,應將污染物的行為影響和毒性機理研究相結合,更好的服務于水質監測。

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Study on Behavioral Change of Zebrafish Exposed to Malathion and Chlorothalonil

Lu Nannan1,Li Ru2,Song Wuchang1,Sun Shaohua1,Jia Ruibao1,*
1.Shandong Province City Water and Drainage Water Quality Monitoring Center,Jinan 250021,China
2.Shandong Jianzhu University,Jinan 250101,China

28 May 2015 accepted 20 July 2015

Behavioral changes of zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil were studied in this paper.After treatment for 24 h,48 h,72 h and 96 h,median lethal concentration was determined by acute toxicity test.Employed LC50-48has a toxic unit(TU,toxicity unit),behavioral test of zebrafish exposed to 0.01 TU,0.1 TU,0.5 TU, 1 TU and 2 TU were also implemented.Result from this study demonstrated that LC50values of the adult zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil for 48 h were 5mg·L-1and 0.01mg·L-1respectively.Associated with upregulation of pollutant concentrations,zebrafish behavior strength changes appeared an increasing trend.And there was a regulation and adaptation process after dramatically increasing or decreasing of its behavior strength,which was accorded with environmental stress model.According to multiple comparisons of behavioral indicators at dif-ferent frequencies,zebrafish fins swing was observed to be the most significantly influenced by malathion and chlorothalonil.This study suggests that the monitoring of zebrafish fins swing may be used as a parameter in water quality monitoring.

malathion;chlorothalonil;zebrafish;behavioral changes

2015-05-28 錄用日期:2015-07-20

1673-5897(2016)1-369-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150528003

逯南南,李汝,宋武昌,等.馬拉硫磷和百菌清脅迫下斑馬魚行為變化的研究[J].生態毒理學報,2016,11(1):369-374

Lu N N,Li R,Song W C,et al.Study on behavioral change of zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(1):369-374(in Chinese)

山東省自然科學基金項目(ZR2014CP019)；國家水體污染控制與治理科技重大專項“南水北調山東受水區飲用水安全保障技術研究與綜合示范”課題(2012ZX07404-003)；直飲水科技惠民示范工程(2013GS370202)

逯南南(1984-),女,工程師,研究方向為飲用水安全評價,E-mail:nanwang316@163.com

),E-mail:jiaruibao68@126.com

簡介:賈瑞寶(1968—)，男，工學博士，研究員，主要研究方向飲用水安全保障，發表學術論文數十篇。