銅在日本青鳉體內的累積特征及其對肝臟組織結構的影響

趙艷民，王洪盼,，溫泉，曹偉，劉志超，楊晨晨，劉憲斌，秦延文,*

1.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室國家環境保護河口與海岸帶環境重點實驗室，北京100012

2.天津科技大學天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457

銅在日本青鳉體內的累積特征及其對肝臟組織結構的影響

趙艷民1，王洪盼1,2，溫泉1，曹偉1，劉志超1，楊晨晨1，劉憲斌2，秦延文1,*

1.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室國家環境保護河口與海岸帶環境重點實驗室，北京100012

2.天津科技大學天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457

為了解水體銅(Cu(II))在日本青鳉(Oryzias latipes)腦、鰓、肝臟、性腺和肌肉組織中的累積特征,以及Cu(II)對肝臟組織結構的影響,本文采用生態學單因子梯度實驗,進行20 d的日本青鳉毒性暴露試驗。結果顯示,日本青鳉各個組織對Cu(II)的累積量隨著濃度的升高而增多,但不同組織對Cu(II)的累積量有較大的差異,銅累積量由大到小依次為:肝臟＞腦＞鰓＞性腺＞肌肉。銅暴露后的日本青鳉肝細胞出現腫大、大小不一、排列混亂,靜脈擴張淤血,部分肝細胞固縮和壞疽等現象。肝臟是日本青鳉蓄積銅的主要器官之一,實驗發現高濃度的Cu(II)對肝臟組織結構造成了明顯的損傷,進而嚴重影響日本青鳉的存活率。

銅離子；日本青鳉；累積；組織結構

日本青鳉(Oryzias latipes)隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鶴鱵目(Beloniformes)、異鳉科(Adrianichthyidae),青鳉屬(Oryzias),成魚體長20～40 mm之間,廣泛分布于中國,東部從遼河到海南省,西到關中及四川省均有分布,國外在朝鮮西部及日本本州也有分布。日本青鳉已被經濟合作發展組織(OECD)、國際標準化組織(ISO)及美國環境保護局(US EPA)等機構推薦為實驗用魚之一[1]。

重金屬進入生物體后可與生物體內的大分子如核酸、酶、蛋白質等結合而積累在生物體內的各個組織器官中。近年來,國內外眾多研究者針對銅對水生動物組織的累積及分布特征開展了相關研究,主要有羅非魚(Oreochromis mossambicus)、淡水白鯧(Colossoma brachypomum)、鯉魚(Cyprinus carpio)和鯽魚(Carassius auratus)[2-6],而銅在日本青鳉組織中的積累以及對肝臟組織結構造成的影響還未見報道。由于生物體內器官的特點及代謝機制的差異性,導致生物體對銅、鎘等重金屬的吸收和解毒機制不完全相同,乃至同一生物體的不同器官組織對重金屬的積累分布也會有差異。本研究在飼養日本青鳉的水體中添加不同濃度的Cu(II),通過測定其腦、鰓、肝臟、性腺、肌肉內的銅含量,以及采用組織切片技術,從細胞學的角度初步了解重金屬銅對肝臟組織結構的影響,以期為研究重金屬在魚體內的積累、分布及遷移規律提供理論參考,為漁業工程制定水質標準和環境保護提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

實驗采用電感耦合等離子體質譜儀ICP-MS 7500(安捷倫科技有限公司,美國)、FD-1C-80冷凍干燥機(北京博醫康技術公司,北京)、EG35B可調式電熱板(北京萊伯泰科儀器股份有限公司,北京)、Leica CM1950冷凍切片機(Leica公司,德國)等器材。CuSO4·5H2O購自國藥集團化學試劑有限公司,其他使用的化學品均為分析純(AR)。試驗前稱取CuSO4·5H2O 3.906 g,定容1 L,配制成一定濃度的母液,實驗時再根據預實驗的結果稀釋成所需的實驗濃度。

1.2 試驗用日本青鳉與飼養管理

日本青鳉由中國環境科學研究院人工模擬養殖基地馴養,成魚體長(2.82±0.31)cm,體重(0.42±0.12) g。實驗用水為經曝氣的自來水配制,pH值為7.1～7.4,溶解氧為6.8～8mg·L-1,總硬度(均值)250mg·L-1(以CaCO3計),水溫(24±1)℃。光照周期為16 h∶8 h(晝∶夜)。

實驗水體的Cu(II)對日本青鳉暴露試驗采用靜態染毒法,在15 L的實驗水族箱中加入10 L含不同銅離子濃度的飼養水體。根據銅對日本青鳉的急性毒性試驗,Cu(II)對日本青鳉的96 h-LC50為2.032mg·L-1,正式試驗組的濃度設定分別取96 h-LC50的1/50、1/20、1/10及1/5,即分別為0.04、0.10、0.20及0.40mg·L-1。每個水族箱放入10尾日本青鳉魚,持續曝氣,每個濃度組設3個平行,實驗暴露時間20 d。

1.3 分析方法

1.3.1 銅含量的測定

取出實驗魚的鰓、腦、肝臟、卵巢和肌肉組織,在60℃下烘48 h,至樣品干燥,粉碎研磨后準確稱重。然后置于三角瓶中,加入2 mL濃HNO3(質量分數65%)和0.5 mL HClO4(質量分數70%)混勻放置過夜,然后在120℃下消解3 h,至溶液澄清為止,冷卻后定容到10 mL,用去離子水稀釋至刻度并搖勻。使用電感耦合等離子體質譜儀直接測定樣品中的Cu(II)含量,每實驗組測定3個平行樣。

1.3.2 組織切片

取日本青鳉肝臟的新鮮組織,用冷凍切片專用膠水包埋,Leica CM1950冷凍切片機(Leica公司,德國)冷凍切片,厚度為8μm,H.E.染色,脫水封片。用LeicaDM2500顯微鏡(Leica公司,德國)進行觀察和拍照。

1.4 數據處理

本實驗所得數據均用SPSS19.0軟件進行處理。以3個平行組數據計算平均值±標準差(Mean±SD),采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法檢驗,顯著性水平P＜0.05。

2 結果(Results)

2.1 不同銅離子濃度條件下日本青鳉的存活率

不同Cu(II)濃度實驗組日本青鳉存活率見圖1。暴露20 d后,隨著水體中Cu(II)濃度的上升,日本青鳉的存活率降低。0.04、0.10mg·L-1Cu(II)濃度組日本青鳉存活率分別為88.89%、82.22%,組間沒有顯著性差異(P＞0.05),但與對照組相比顯著性降低(P＜0.05),0.40mg·L-1濃度組日本青鳉存活率降低至53.33%,約為對照組的1/2。

圖1 不同Cu(II)濃度條件下處理20 d后日本青鳉的存活率注:圖中上標字母相同表示差異不顯著(P＞0.05)。Fig.1 Survival rate ofOryzias latipesexposed to different concentrations of Cu(II)for 20 daysNote:Bars with the same letter show no significant difference(P＞0.05).

2.2 Cu(II)在日本青鳉各組織中的累積

日本青鳉不同的組織器官對Cu(II)具有不同的吸收能力?？傮w結果是肝臟＞腦＞鰓＞性腺＞肌肉(見圖2)。對照組日本青鳉腦、鰓、肝臟、性腺和肌肉中Cu(II)的含量分別為32.27、15.48、20.41、5.85和2.35μg·g-1(干重)。

實驗組日本青鳉肝臟中的銅含量隨著水體銅濃度的增加迅速增高,濃度為0.04mg·L-1處理組青鳉肝臟銅積累量已達59.14μg·g-1(干重),與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05),0.40mg·L-1濃度組積累量高達137.59μg·g-1(干重),與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05),是對照組的6.74倍,且分別是同一Cu(II)濃度處理組腦、鰓、性腺和肌肉中Cu(II)含量的1.39倍、2.10倍、5.92倍和16.44倍。

暴露濃度在0～0.20mg·L-1的濃度范圍內,日本青鳉腦中的銅含量與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；當Cu(II)濃度達到0.40mg·L-1時,腦中的Cu(II)含量急劇上升,達到98.69μg·g-1(干重),是對照組的3.06倍,顯著高于對照組(P＜0.05)。

日本青鳉鰓中的銅含量隨著Cu(II)濃度的升高而增加,但在0～0.10mg·L-1的濃度范圍內增加量與對照組無顯著差異(P＞0.05)；當Cu(II)濃度達到0.20mg·L-1時,鰓中的Cu(II)含量達到32.55μg·g-1(干重),顯著高于對照組(P＜0.05)。

性腺中Cu(II)含量較低,當水體中Cu(II)濃度為0.10mg·L-1時,性腺中Cu(II)含量為8.55μg·g-1(干重),與對照組無顯著性差異(P＞0.05)；當Cu(II)濃度在0.20mg·L-1以上時,性腺中的Cu(II)含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。而且隨著濃度的增大,積累量越來越大。

肌肉組織中Cu(II)含量最低,但當處理組中Cu(II)濃度為0.04mg·L-1時,肌肉組織中Cu(II)含量顯著地增加到5.16μg·g-1(干重),顯著高于對照組(P＜0.05)。隨著處理組Cu(II)濃度的升高,肌肉中Cu(II)含量也隨之增高,顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖2 不同Cu(II)濃度下日本青鳉各組織中的銅離子含量注:圖中上標字母相同表示差異不顯著(P＞0.05),反之表明差異顯著(P＜0.05)。Fig.2 Copper content in different tissue ofOryzias latipes exposed to different concentrations of Cu(II)Note:Bars with the same letter show no significant difference(P＞0.05)；conversely show significant difference(P＜0.05).

2.3 Cu(II)對日本青鳉肝臟組織的影響

組織學結果顯示,對照組中的日本青鳉肝臟組織結構沒有受到顯著地損傷,其肝臟細胞排列規則且比較完整,胞質比較均勻,胞質染色較深(圖3A)。經過20 d的銅暴露下,發現日本青鳉肝臟組織的結構損傷主要包括:靜脈擴張淤血、部分肝細胞固縮和壞疽,而且隨著暴露水體銅離子濃度的增加,肝臟的結構損傷更嚴重。0.1mg·L-1處理組日本青鳉肝臟出現了少許的靜脈擴張淤血(圖3B)；0.2mg·L-1處理組肝臟出現多處靜脈擴張淤血(圖3C)；0.4mg·L-1處理組肝臟出現了較為嚴重的結構損傷:肝臟細胞固縮和壞疽以及大量的靜脈擴張淤血等(圖3D)。

圖3 對照組(A)與銅處理組(B～D)日本青鳉肝臟的組織切片注:(A)對照組日本青鳉肝臟組織,正常的肝細胞(a)和血管(bv),H.E.,×200；(B)0.1mg·L-1處理組,靜脈擴張淤血,H.E., ×200；(C)0.2mg·L-1處理組,靜脈擴張淤血,H.E.,×200；(D)0.4mg·L-1處理組,靜脈擴張淤血,部分肝細胞固縮和壞疽(b),H.E.,×200。Fig.3 Liver histology ofOryzias latipesin control(A)and copper exposed group(B-D)

3 討論(Discussion)

3.1 水體Cu(II)對日本青鳉體內Cu(II)分布的影響

通常認為魚體對重金屬的吸收途徑主要為:1)魚體鰓吸收水體中重金屬離子(溶解態),并且通過血液輸送到各組織器官中；2)經過消化道吸收水體或殘留在餌料中的重金屬；此外,重金屬進入魚體內還可以通過水體與體表的滲透交換作用[6]。本研究表明,日本青鳉體內所觀測的各個組織中都有銅積累,但Cu(II)在日本青鳉體內的積累具有高度的選擇性。銅主要積累于肝臟和腦中,而在鰓、性腺和肌肉中積累較少,各組織內銅累積量排序為肝臟＞腦＞鰓＞性腺＞肌肉。這與Kargin等[2]、劉曉燕等[4]、陳再忠等[45]報道的羅非魚、淡水白鯧、鯉魚、鯽魚和錦鯉的結果類似。銅是生物體必需的微量元素,也是腦、血、肝等銅蛋白組成的成分,在多種酶活性中扮演重要角色。它們起著維持生命正常發育和新陳代謝的作用。但過量的Cu(II)可使魚體肝臟中的溶酶體膜磷脂發生氧化反應,進而使溶酶體膜破裂,大量釋放水解酶,最終引起魚體肝組織壞死[4]。

魚體肝臟組織對銅的富集較高,原因主要是在Cu(II)作用下肝臟能夠迅速并大量合成金屬硫蛋白(MT),使得重金屬大量蓄積在組織體內,從而成為蓄積重金屬的重要靶器官[7]；肝臟中形成了大量銅金屬硫蛋白,并以非毒的形式存于魚體內,所以銅在內臟中的累積量遠遠大于肌肉和鰓組織[3]。

3.2 Cu(II)對日本青鳉肝臟組織的影響

肝臟是魚類體內進行代謝和解毒的重要器官,而且也是銅對魚類產生危害的靶器官[8-9],魚中毒后肝臟表現為多發性的溶解壞死和細胞的變性。重金屬對生物體的危害作用,主要是由于其能誘導產生活性氧自由基從而造成氧化損傷[10-12]。

本實驗對照組中的日本青鳉肝臟組織,其肝臟細胞排列規則而且比較完整,胞質比較均勻,胞質染色較深。這與郭海山等[13]、陳輝輝等[14]研究的草魚、唐魚的結果類似。經過20 d的銅暴露下,低濃度Cu(II)處理組日本青鳉肝臟出現了少許的細胞排列混亂、大小不一、肥大等較輕的結構損傷,這與Bruslé等[15]報道的結果類似,分析原因可能為肝臟組織自身具有降低其毒性的能力,所以較低濃度下肝臟結構損傷較??；當毒物濃度過高,超過了肝臟的解毒能力,就會對肝臟的組織結構產生不同程度的影響[16]。劉香江等[17]、Daoust等[18]的研究表明高濃度銅暴露時矛尾復蝦虎魚、虹鱒肝臟組織出現靜脈擴張淤血、細胞核固縮、胞漿內出現大量的空泡；Strmac和Braunbeck[19]的研究結果表明,高濃度苯基錫醋酸暴露時斑馬魚肝臟組織細胞出現嚴重固縮現象；Korkmaz等[20]、Velmurugan等[21]的研究表明高濃度氯氰菊酯暴露時尼羅羅非魚、鯪魚肝臟組織出現了肥大、肝竇變窄及脂肪空泡；本次試驗中,高濃度Cu(II)處理組日本青鳉肝臟出現了大量的靜脈擴張淤血、部分肝細胞固縮和壞疽等較為嚴重的結構損傷。銅對日本青鳉肝臟結構損傷的現象與其他相關毒物對魚類肝臟的毒害作用以及由于環境污染等原因而造成魚類的肝臟組織結構的變化結果基本一致,可能是因為銅代謝主要在肝臟中完成,而肝臟組織細胞的變性、壞死等又對肝功能造成障礙,致使銅離子積聚在魚體各個組織器官中,最終魚類的毒性反應加重[17,19]。

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Accumulation Characteristic of Cu(II)in Oryzias latipes and Its Effect on Liver Histology Structure

Zhao Yanmin1,Wang Hongpan1,2,Wen Quan1,Cao Wei1,Liu Zhichao1,Yang Chenchen1,Liu Xianbin2,Qin Yanwen1,*
1.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment,State Environmental Protection Key Laboratory of Estuary and Coastal Environment,Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China
2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China

30 April 2015 accepted 6 July 2015

In the present study,we investigate the accumulation characteristic of Cu(II)in various tissues ofOryzias latipes,as well as to explore the effects of Cu(II)on liver.Oryzias latipeswere exposed to Cu(II)solutions for 20 days using singe gradient factor experiments.We found that the accumulation of Cu(II)in vivo enhances significantly in a concentration dependent manner with the increase of Cu(II)concentration.In addition,the accumulations of Cu(II)varied sharply in different tissues,and the accumulations presented an order as following:liver＞brain＞gill＞gonad＞muscle.Light microscopic observation showed that the histology structure of liver changed greatly after Cu(II)exposure,such as the enlargement,chaotical arrangement and size variation of the hepatocytes,and the congestion of the central vein with blood cells and focal necrosis of hepatytes.The liver was one of the main tissues of accumulation of Cu(II).In this study,we found exposure to high concentrations of Cu(II)could bring severe damage to the liver tissue structure,which maybe ultimately affect the survival and growth ofOryzias latipes.

Cu(II);Oryzias latipes;accumulation;histology structure

2015-04-30 錄用日期:2015-07-06

1673-5897(2016)1-323-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150430002

趙艷民,王洪盼,溫泉,等.銅離子在日本青鳉體內的累積特征及其對肝臟組織結構的影響[J].生態毒理學報,2016,11(1):323-328

Zhao Y M,Wang H P,Wen Q,et al.Accumulation characteristic of Cu(II)inOryzias latipesand its effect on liver histology structure[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):323-328(in Chinese)

國家水體污染控制與治理科技重大專項項目(2012ZX7503)

趙艷民(1979-),男,副研究員,研究方向為環境毒理與風險評價,E-mail:zhaoym@craes.org.cn

),E-mail:qinyw@craes.org.cn

簡介:秦延文(1973—)，女，博士，研究員，主要研究方向環境化學及環境風險評價。