大黃酸?纈氨酸加合物的合成及初步抗腫瘤活性

張　潔，周昌健，謝建偉，代　斌

（石河子大學化學化工學院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室?省部共建國家重點實驗室培育基地，石河子832003）

大黃酸?纈氨酸加合物的合成及初步抗腫瘤活性

張潔，周昌健，謝建偉，代斌

（石河子大學化學化工學院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室?省部共建國家重點實驗室培育基地，石河子832003）

以大黃酸為原料，經酯化、烷基化、水解及縮合等反應步驟合成了12個大黃酸?纈氨酸加合物.目標化合物經1H NMR，13C NMR和HRMS進行了結構確證.以順鉑和阿霉素為陽性對照藥，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法考察了目標化合物的體外抗腫瘤（Hela，MCF?7，HepG2，KB和HEK293T等5株細胞）活性.結果表明，化合物5l顯示出較好的抗腫瘤活性，其IC50值在1.6～9.4 μmol／L之間.作用機制研究結果表明，化合物5l能夠與DNA發生較強的結合作用.

大黃酸；纈氨酸；加合物；抗腫瘤活性；構效關系

大黃（Rheum palmatum L.）是一種多年生草本植物，是我國的傳統中藥材之一.大量研究［1］表明，大黃的主要化學成分包括蒽醌類、二蒽酮類及蒽酮甙類等，其中蒽醌類（如大黃酸、大黃素甲醚、大黃素、蘆薈大黃素和大黃酚等）約占大黃成分的4％左右，其藥理作用極其廣泛.現代研究［2］證實，蒽醌甙類為大黃引起腹瀉的有效成分；游離蒽醌類能起到抑菌及抗腫瘤的作用；游離蒽醌和蒽醌甙類為大黃降血脂、抗氧化的有效成分；此外，這些蒽醌衍生物還具有抗血管生成等作用.近幾十年來的藥理學研究表明，大黃酸在保護肝臟［3，4］、抗腫瘤［5～10］、抗菌［11～13］及抗糖尿?。?0，14，15］等方面都具有活性.因此，大黃酸的結構修飾備受關注.Ye等［16］合成了系列大黃酸?磷酸衍生物，并以HepG2和CNE等腫瘤細胞株為目標進行體外細胞毒性測試，得到一些活性較高的化合物.Liang等［17］從大黃酸出發，合成了2個系列的蒽［2，1?d］噻唑?6，11?二酮衍生物，其對A549和Hela細胞的抑制效果比大黃酸提高了約30倍.紀春梅等［18］研究發現，賴氨大黃酸能夠通過抑制順鉑對ERK的激活，影響Capase3，Caspase?7和PARP的切割片段蛋白表達，加強了順鉑對肺癌細胞的凋亡誘導進程.

本文以大黃酸為原料，先將3?位酯化生成大黃酸乙酯，再對1，8?位進行取代，而后將3?位的酯水解成羧基進而與纈氨酸乙酯鹽酸鹽發生縮合，再通過水解及成鹽反應得到目標產物.采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法考察了目標化合物在細胞水平的體外抗腫瘤活性，并對其作用機理進行了初步研究.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

大黃酸（分析純）購自上海多點化工有限公司；碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷、1?溴丁烷和溴化芐等烷基化試劑均為分析純，購自阿拉丁試劑公司；纈氨酸乙酯鹽酸鹽（分析純）購自Adamas試劑公司；ct?DNA購自Sigma?Aldrich公司；其它試劑及溶劑均為分析純.

WRS?1B型數字熔點儀（上海精密科學儀器有限公司）；ZF?2型紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）；Bruker AVANCEⅢHD 400型核磁共振儀（CDCl3或DMSO?d6為溶劑，TMS為內標，瑞士布魯克公司）；AL104型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Model 680型酶標儀（美國伯樂生命醫學產品有限公司）；柱色譜用硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；F?2500型熒光光譜儀（日本日立公司）；美譜達UV?3200PCS紫外?可見吸收光譜儀（上海美譜達儀器有限公司）；1 cm石英比色皿（北京瑞澤康生物科技有限公司）.

1.2 目標化合物的合成

目標化合物的合成路線如Scheme 1所示.

3a，4a，5a：R＝Methyl；3b，4b，5b：R＝ethyl；3c，4c，5c：R＝propyl；3d，4d，5d：R＝n?butyl；3e，4e，5e：R＝benzyl；3f，4f，5f：R＝2，6?dichlorobenzyl；3g，4g，5g：R＝4?chlorobenzyl；3h，4h，5h：R＝4?fluorobenzyl；3i，4i，5i：R＝3?fluoro?benzyl；3j，4j，5j：R＝4?isopropylbenzyl；3k，4k，5k：R＝phenylethyl；3l，4l，5l：R＝phenylpropylScheme 1 Synthetic routes of target compounds 5a—5l（1）SOCl2，EtOH，reflux；（2）RX，NaH，DMF；（3）1 mol／L NaOH（aq），then 1 mol／L HCl（aq）；（4）NH2CH（R2）COOEt，EDCI，DMAP，CH2Cl2；（5）1 mol／L NaOH，then 1 mol／L HCl（aq）.

1.2.1 中間體2的合成 將2.84 g（10 mmol）大黃酸、40 mL無水乙醇和10 mL SOCl2加入250 mL圓底燒瓶中，加熱至回流反應24 h，待原料完全轉化，將反應液倒入1 L蒸餾水中，抽濾，并用大量蒸餾水洗滌固體，將固體在真空干燥箱中充分干燥，得到2.934 g黃色固體化合物2.產率為94％，m.p. 155.3～156.0℃.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：12.02（s，1H），11.97（s，1H），8.42（d，J＝0.8 Hz，1H），7.94（d，J＝1.2 Hz，1H），7.88（d，J＝7.2 Hz，1H），7.73（t，J＝8.0 Hz，1H），7.34（d，J＝8.4 Hz，1H），4.45（q，J＝7.6 Hz，2H），1.45（t，J＝7.2 Hz，3H）.

1.2.2 中間體3a～3l的合成 取3.12 g（10 mmol）化合物2、250 mL N，N?二甲基甲酰胺和1.5 g（50 mmol）NaH加入圓底燒瓶中，攪拌10 min后，加入7.5 mL鹵代烷烴（0.12 mol）.在90～130℃下反應，用TLC監測反應進程.反應結束后，將反應液倒入到300 mL 1 mol／L HCl溶液中，并用二氯甲烷萃取，合并有機相，減壓濃縮得到的粗產物，再用硅膠柱層析［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）＝5∶1］分離，并將粗產物直接加入到200 mL 1 mol／L NaOH溶液中，在室溫至60℃下攪拌，用TLC監測反應進程.待水解完畢后，用HCl（1 mol／L）溶液調節pH＝5～6，有固體析出，抽濾，并用大量去離子水洗滌.將固體充分干燥即得到黃色固體化合物3a～3l，其理化性質數據列于表1，1H NMR數據列于表2.

Table 1 Appearances，yields and melting points of compounds 3a—3l

Table 21H NMR data of compounds 3a—3l

Continued

1.2.3 中間體4a～4l的合成 取化合物3a～3l（5 mmol）、1.2 mL 4?二甲氨基吡啶（DMAP，10 mmol）、1?乙基?（3?二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDCI，7.5 mmol）和1.1 g（6 mmol）纈氨酸乙酯鹽酸鹽混合，加入100 mL二氯甲烷，在室溫下攪拌反應，用TLC監測反應進程.待反應結束后，將反應液緩慢倒入150 mL 0.1 mol／L HCl溶液中，并用二氯甲烷萃取3次，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮.經柱層析分離［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）＝2∶1］純化得黃色液體，減壓濃縮至干，得黃色固體化合物4a～4l，其理化性質數據列于表3，1H NMR數據列于表4.

Table 3 Appearances，yields and melting points of compounds 4a—4l

Table 41H NMR data of compounds 4a—4l

Continued

1.2.4 大黃酸?纈氨酸偶聯物（5a～5l）的合成 取0.4 g（1 mmol）化合物4a～4l溶于10 mL乙醇中，滴加20 mL 1 mmol／L NaOH溶液，在室溫至70℃下攪拌反應，用TLC監測反應進程.待反應結束，將反應液緩慢倒入20 mL 1 mmol／L HCl溶液中，攪拌過程中析出黃色固體，直接將固體過濾，并用大量蒸餾水洗滌，即得大黃酸?纈氨酸加合物5a～5l.目標化合物的理化性質數據列于表5，1H NMR和13C NMR數據列于表6.

Table 5 Appearances，yields，melting points and HRMS data of target compounds 5a—5l

Table 61H NMR and13C NMR data of target compounds 5a—5l

Continued

1.3 體外抗腫瘤活性測試

采用MTT法［19～22］測試了目標化合物5a～5l對子宮頸癌細胞（Hela）、人肝癌細胞（HepG?2）、人乳腺癌細胞（MCF?7）、人口腔表皮癌細胞（KB）及人胚腎細胞（HEK?293T）的體外抑制活性.為提高目標化合物的水溶性，制成鈉鹽用于實驗，活性測試結果見表7.

Table 7 Antitumor activity of target compoundsin vitro?

1.4 化合物5l與ct?DNA相互作用研究

研究小分子藥物與DNA之間的相互作用模式對于揭示抗腫瘤藥物的作用機制、設計新型的以DNA為靶標的抗腫瘤藥物具有重要的指導意義.大黃酸類化合物具有共平面的蒽醌環結構，可作為DNA的嵌入劑插入到DNA堿基對中，抑制DNA的轉錄和復制功能，從而表現出細胞毒性.由于DNA分子本身及作為探針的小分子均具有豐富的光譜活性，而且小分子與DNA結合后，其光譜性質通常會發生變化，因此光譜法是研究小分子與DNA作用的有力手段.本文采用紫外?可見光譜法和熒光光譜法研究了化合物5l與DNA的相互作用，初步判定了該衍生物與DNA的結合方式.

將ct?DNA固體配制成溶液，通過測定260 nm處的紫外吸收值確定其準確濃度為3.77×10－4mol／L，純度A260／A280＝1.82，保存于1～4℃冰箱中；濃度為0.01 mol／L Tris?HCl緩沖溶液（含有0.01 mol／L的NaCl，pH＝7.4）.實驗用水為二次蒸餾水.

紫外?可見吸收光譜測試：在一系列10 mL比色管中加入2.0 mL Tris?HCl緩沖溶液（pH＝7.4），一定濃度的化合物5l溶液和適量的ct?DNA溶液，再用緩沖溶液定容.在室溫下放置過夜，在200～800 nm的掃描范圍內，以相同濃度的純ct?DNA溶液作為參比溶液，依次測試加入不同體積的DNA溶液后溶液的吸光度的變化，得到化合物與DNA相互作用的紫外吸收光譜圖.加入DNA溶液的濃度分別為0，8，16，24，32和40 μmol／L.

熒光光譜測試：用Tris?HCl緩沖溶液（pH＝7.4）配制濃度為1×10－5mol／L的化合物5l溶液，向此溶液中加入不同體積的ct?DNA溶液，使DNA濃度分別為0，8，16，24，32和40 μmol／L，在激發波長為260 nm時，依次測試溶液的熒光發射光譜，得到化合物與DNA相互作用的熒光光譜圖.

2 結果與討論

2.1 化合物的合成

以大黃酸為原料，首先以SOCl2為催化劑，乙醇為溶劑，得到3?羧酸乙酯（2）；化合物2與不同的鹵代烴在NaH催化下發生醚化反應，隨后在NaOH水溶液中進行酯水解反應，得到1，8?二烷氧基大黃酸（3a～3l）；化合物3a～3l在EDCI／DMAP存在下，與纈氨酸酯發生縮合反應得到化合物4a～4l，最后氨基酸酯水解得到目標化合物5a～5l.所有化合物的結構經1H NMR，13C NMR和HRMS確證.

2.2 體外抗腫瘤活性及初步構效關系分析

以順鉑（DDP）和阿霉素（Doxorubicin）作為陽性對照藥.為提高目標化合物的水溶性，將其制成鈉鹽用于實驗.實驗結果表明，甲氧基、乙氧基和丙氧基位于大黃酸C1，8位點時，所有衍生物均未表現出抗腫瘤活性；而丁氧基位于C1，8位時，所有衍生物的抗腫瘤活性有所提高；芐氧基位于C1，8位時，整體抗腫瘤活性進一步提高，化合物5e對所測試的5個細胞株均表現出顯著的抑制活性（IC50＜50 μmol／L）.在不同取代的芐氧基位于C1，8位的化合物中，吸電子基團取代的芐基衍生物整體上未表現出明顯的抗腫瘤活性，其IC50值均大于100 μmol／L，僅化合物5i對所測的5株細胞顯示出明顯的抗腫瘤活性（IC50值：12.9～38.6 μmol／L），但其活性仍略低于連有供電子基團的化合物5j（IC50值：1.9～37.5 μmol／L）.對比芐氧基（5e）、苯乙氧基（5k）和苯丙氧基（5l）取代C1，8位時，奇數亞甲基取代的化合物的體外抗腫瘤活性比其它系列化合物的活性都高，其中化合物5l對所測5株細胞的IC50值在1.6～9.4 μmol／L之間.

Fig．1 UV?Vis spectra（A）and fluorescence spectra（B）for compound 5l with different concentrations of ct?DNA

2.3 化合物5l與ct?DNA的相互作用

化合物5l與DNA相互作用的紫外?可見光譜圖如圖1（A）所示.當DNA加入化合物5l時，化合物的紫外?可見吸收出現減色效應，并隨著DNA加入量的增加，減色效應變得更加明顯，但紅移并不明顯.這符合Long等［23］提出的證明小分子與DNA分子發生嵌插作用的依據，由此推測化合物與DNA存在嵌插作用.從化合物5l與DNA相互作用的熒光光譜圖［圖1（B）］可知，隨著DNA濃度的增加，化合物的熒光出現猝滅，表明化合物的蒽醌環部分進入了DNA雙螺旋結構的影響區域，與DNA發生結合作用［24］.因此，化合物5l具有較強的體外抗腫瘤活性的原因是該化合物能夠與ct?DNA發生較強的結合作用，其結合方式可能以嵌插為主，多種作用方式并存，從而起到抑制腫瘤細胞的DNA的轉錄和復制作用.

3 結 論

以大黃酸為原料，設計合成了12個新的大黃酸?纈氨酸加合物，通過1H NMR，13C NMR和HRMS確證了目標化合物的結構.初步的構效關系研究表明，在大黃酸的1，8位引入烷基苯，3位引入纈氨酸結構能夠有效地增強抑制活性.作用機制研究表明，該類化合物能夠與ct?DNA較強結合，其結合方式可能以嵌插為主，多種作用方式并存.

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（Ed.：P，H，Y，K）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21606153）and the Outstanding Youth Project of Shihezi University，China（No.2013ZRKXYQ?YD01）.

Synthesis and Antitumor Activities of Rhein?Valine Adducts?

ZHANG Jie，ZHOU Changjian，XIE Jianwei?，DAI Bin
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In order to search for novel leading compounds endowed with better antitumor activities，twelve novel rhein?valine derivatives were designed and synthesized by modification of position?1，3 and 8 of rhein nucleus，and their structures were confirmed by1H NMR，13C NMR and HRMS.All the target compounds were tested for cytotoxic activity against five cancer cell lines including Hela，MCF?7，HepG2，KB and HEK293T by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）method in vitro.The results demonstrate that compound 5l displayed a broad spectrum of cytotoxic activities with IC50value of lower than 10 μmol／L against all tumor cell lines，compounds 5e，5i and 5j only demonstrated moderate cytotoxic activities（IC50＜50 μmol／L）.Primary structure?activity relationships（SARs）analysis indicated that the 3?phenylpropoxyl substituents in position?1，8 of rhein nucleus were the suitable pharmacophoric group giving rise to significant antitumor agents.In addi?tion，compound 5l was found to exhibit remarkable DNA intercalating effects.

Rhein；Valine；Adduct；Antitumor activity；Structure?activity relationship

O626

A

10.7503／cjcu20160568

2016?08?11.網絡出版日期：2016?11?15.

國家自然科學基金（批準號：21606153）和石河子大學優秀青年科技人才培育計劃（批準號：2013ZRKXYQ?YD01）資助.

聯系人簡介：謝建偉，男，博士，副教授，主要從事藥物化學研究.E?mail：cesxjw＠foxmail.com