64Cu?NOTA?Herceptin的設計、活性測定及腫瘤靶向分子顯像研究

朱　華，李一林，趙傳科，解清華，，劉　菲，韓雪迪，高　靜，夏傳琴，沈　琳，楊　志

（1.北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所核醫學科，2.消化腫瘤內科，3.生化與分子生物學研究室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京100142；4.四川大學化學學院，成都610041）

64Cu?NOTA?Herceptin的設計、活性測定及腫瘤靶向分子顯像研究

朱華1，李一林2，趙傳科3，解清華1，4，劉菲1，韓雪迪1，高靜1，夏傳琴4，沈琳2，楊志1

（1.北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所核醫學科，2.消化腫瘤內科，3.生化與分子生物學研究室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京100142；4.四川大學化學學院，成都610041）

利用雙功能螯合劑2?［（4?異硫氰基苯基）甲基］?1，4，7?三氮雜環九烷?1，4，7?三乙酸（NCS?Bz?NOTA）對Herceptin單抗表面的氨基進行修飾獲得了NOTA?Herceptin，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI?TOF）對該偶聯物進行了表征.利用酶聯免疫吸附測定了偶聯前后Herceptin抗體效價的改變.利用新型正電子核素64Cu標記，獲得可用于腫瘤放射靶向精準診療的64Cu?NOTA?Herceptin探針，其標記率為90％，放化純度＞98％，比活度185 MBq／nmol.分別進行了該探針在HER2過表達胃癌細胞NCI?N87及HER2低表達胃癌細胞BGC823等腫瘤細胞中的攝取實驗，測定了該探針的腫瘤特異性.建立了荷人胃癌BGC823裸鼠模型，通過微型正電子斷層顯像（Micro?PET）設備觀察了探針在模型動物體內的代謝情況：在靜脈注射7.4 MBq64Cu?NOTA?Herceptin探針后，分別于4和60 h進行正電子斷層顯像（PET）的顯像，觀察到其在腫瘤部位的攝取有所富集，且隨著代謝時間的延長，肝臟部位攝取得到明顯降低.研究結果表明，64Cu?NOTA?Herceptin探針有望應用于腫瘤放射性靶向診療.

曲妥珠單抗；64Cu；免疫活性；分子顯像；腫瘤靶向診療

胃癌是亞洲的“專屬癌癥”.胃癌難以診斷，超過一半患者因在確診時即為晚期而失去手術機會.以藥物治療為主的綜合治療仍為目前晚期胃癌治療的主要手段.然而，迄今為止，化療藥物在胃癌治療中的有效率非常有限，且毒副作用大［1］.

以單克隆抗體為代表的腫瘤分子靶向治療日益成為腫瘤治療的重要手段.目前已有多種單抗應用于腫瘤靶向治療.但對于胃癌，單抗靶向治療進展仍較滯后.2010年，國際多中心Ⅲ期臨床研究結果顯示，以人表皮生長因子受體2（HER2）為靶點的曲妥珠單抗（Herceptin）聯合化學治療對HER2過表達的晚期胃癌與單純化療相比，明顯延長總生存期（OS）［2，3］.由此，Herceptin成為首個并且迄今唯一在晚期胃癌一線治療中確認有生存獲益的靶向藥物，突破性地提高了胃癌治療水平［4］.Herceptin單抗能夠靶向結合胃癌在內的惡性腫瘤細胞膜表面的HER2受體，抑制下游相關信號通路激活，進而抑制腫瘤細胞生長及侵襲轉移.同時，Herceptin結合HER2受體可以啟動機體免疫系統抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用進行腫瘤細胞殺傷.但該多中心研究結果同時顯示，HER2過表達晚期胃癌患者抗HER2靶向治療客觀有效率僅為47.3％.即使初期有效，最終也出現惡性腫瘤復發及耐藥性［5］.此外，Herceptin單抗自身具有較強的心臟毒副作用.不僅如此，單克隆抗體在惡性腫瘤的靶向治療中還表現出高度異質性［6］.如組織學HER2表達陽性患者可從Herceptin抗HER2的靶向治療中獲益.因此，實現靶向藥物在腫瘤治療中的個體化治療、精準治療成為腫瘤診療領域值得關注的問題.分子影像診斷以人全身為探求對象，將腫瘤影像診斷提高到腫瘤細胞特異性表達的分子水平［7］.而快速、精準、無創、有效評價腫瘤靶向治療藥物效果的分子探針的出現，將有望解決腫瘤異質性問題.

本團隊曾將Herceptin修飾后與99mTc標記，獲得99mTc?Herceptin探針，可針對全身系統HER2的表達情況無創顯像.但由于99mTc（半衰期T1／2＝6.9 h）是單光子核素，標記獲得的99mTc?Herceptin空間分辨率較低、半衰期偏短，難以觀察到48 h后探針在體內的代謝情況.2010年，Dijkers等［8］利用89Zr?Herceptin探針進行HER2陽性乳腺癌轉移灶的正電子斷層顯像（PET）研究，取得了較好的效果，也觀察到其在心臟明顯的高攝?。ǜ哂诟文I臟系統）.新型核素64Cu（半衰期T1／2＝12.7 h）具有較長的體內半衰期，能夠長時間、高分辨率地檢測探針在體內的代謝情況，其產生的β－粒子具有放射治療的效果［9］.Tamura等［10］制備出64Cu?DOTA?Herceptin，并進行了6例乳腺癌患者的PET／CT顯像研究，該研究能夠有效區分出HER2陽性乳腺癌的原發灶及轉移灶，且輻射劑量及藥代動力學性質均能符合PET／CT顯像要求.

本文參照文獻［11，12］方法，將Herceptin表面氨基在溫和的條件下與2?［（4?異硫氰基苯基）甲基］?1，4，7?三氮雜環九烷?1，4，7?三乙酸（NCS?Bz?NOTA）偶聯，合成了具有HER2靶向的新型腫瘤顯像劑前體NOTA?Herceptin.而后利用64Cu進行放射性標記，獲得64Cu?NOTA?Herceptin.分別選用HER2高表達人胃癌細胞株NCI?N87及HER2低表達人胃癌BGC823細胞進行細胞攝取實驗，并建立了荷人胃癌BGC823裸鼠模型，靜脈注射7.4 MBq64Cu?NOTA?Herceptin后進行Micro?PET顯像研究，結果表明，標記獲得的單抗基本保持原有的生物學活性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

NCS?Bz?NOTA購自Macro?cyclies公司；N，N?二甲基甲酰胺（DMF）購于西格瑪公司（St.Louis，MO）；64Cu由北京腫瘤醫院核醫學科提供；醋酸鈉（NaAc）購于阿拉丁試劑有限公司；氯化鈉、氯化鉀等購于中國國藥集團化學試劑有限公司；SPF級BALB／c裸鼠（北京維通利華實驗技術有限公司）；自制磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol／L，pH＝7.4）.

Nanodrop 2000型紫外分光光度計（UV?Vis，美國雷諾公司）；PD?10蛋白分離柱（美國GE公司）；1200系列高效液相色譜儀（HPLC，美國安捷倫公司），紫外檢測器吸收峰設為280 nm；SEC?3凝膠色譜柱（150 A，300 mm×7.8 mm，美國安捷倫公司），以0.01 mol／L PBS溶液為緩沖液，等梯度淋洗，流速1.0 mL／min；Radio?TLC放射性薄層掃描儀（德國默克公司），使用ITLC?SG硅膠板，配備Bioscan AR?2000系統.放射性活度經多探頭全自動γ計數器［3?in，NaI（Tl）井型探測器］計量.Micro?PET顯像結果通過SuperArgus系統采集，顯像時間為15 min，所得數據用Sedecal 3D OSEM系統分析處理.

1.2 NOTA?Herceptin的合成及MALDI?TOF分析和生物活性檢測

Herceptin單抗的修飾過程見圖1.先將Herceptin單抗經過PD?10純化，而后取200 μL Herceptin單抗，向其中加入8倍量的NCS?Bz?NOTA雙功能螯合劑，于4℃下振蕩4 h.通過PD?10柱純化后，用UV?Vis及HPLC分析，獲得可用于核素標記的NOTA?Herceptin標記前體.

Fig．1 Modification of Herceptin antibody and radiolabeling methodology of64Cu radionuclide

通過基質輔助激光解吸電離分行時間質譜（MALDI?TOF）技術測定Herceptin修飾前后的分子量.通過采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法檢測NOTA?Herceptin與HER2抗原結合活性來測定NOTA?Herceptin的生物學活性.用包被液將重組人HER2蛋白稀釋至2.5 μg／mL，加入96孔酶標板（100μL／孔），于4℃下放置過夜；洗板3次后，加入200 μL 50 g／L BSA封閉液，于37℃封閉1 h；洗板3次后，將Herceptin及NOTA?Herceptin倍比稀釋，并將不同濃度梯度Herceptin及NOTA?Herceptin加入酶標板中（100 μL／孔），同時加入稀釋液為空白對照，于37℃下孵育1 h；洗板3次后，移取辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗人IgG抗體（1∶1000稀釋，100 μL／孔），于37℃孵育30 min后洗板6次，加入3，3′，5，5′?四甲基聯苯胺（TMB）顯色液，于37℃孵育15 min顯色后，加入50 μL／孔終止液，于酶標儀450 nm處測定吸光度值.

1.364Cu?NOTA?Herceptin的質量控制及細胞攝取實驗

1.3.1 新型核素64Cu的放射性標記 向20 μL（3.7 MBq／μL）64CuCl2溶液中先后加入0.2 mL 0.1 mol／L（pH＝5.5）的NaAc緩沖液和100 μL NOTA?Herceptin，反應30 min后進行Radio?HPLC測定，衰變校正后計算放化產率.經Radio?HPLC對目標產物64Cu?NOTA?Herceptin的放射性峰進行面積積分，計算放化純度.

1.3.2 細胞攝取實驗 進行64Cu?NOTA?Herceptin標記化合物在NCI?N87及BGC823細胞株中的細胞攝取實驗，并在NCI?N87細胞的阻斷組中加入0.1 mg Herceptin／孔的阻斷劑，評價其作為受體顯像劑的活性劑特異性.具體操作參考文獻［13］方法并進行調整.在96孔板中，向每個孔中加入37 kBq的64Cu?NOTA?Herceptin，收集其在2種細胞中不同時間點的攝取數據.將所有試管的放射性含量通過γ?計數器讀取.

1.464Cu?NOTA?Herceptin的Micro?PET顯像觀察

Micro?PET具有較高的空間分辨率（可達1 mm），可以準確反映藥物在動物體內的代謝.本文通過Micro?PET設備觀察64Cu?NOTA?Herceptin探針標記在腫瘤鼠體內的攝取情況.取BALB／c裸鼠（10周齡），在其右前下肢前部植入直徑約0.8 cm的人胃癌細胞BGC823種植瘤.注射前禁食12 h，通過尾靜脈注射7.4 MBq的64Cu?NOTA?Herceptin，分別于注射后4和60 h進行Micro?PET顯像.裸鼠在Summit AS小動物麻醉系統中用混有3％（體積分數）異氟烷的氧氣麻醉，顯像過程維持含1％～1.5％（體積分數）異氟烷的氧氣麻醉.Micro?PET顯像結果通過SuperArgus系統采集，顯像時間為15 min，所得數據用Sedecal 3D OSEM系統分析處理.

2 結果與討論

2.1 NOTA?Herceptin的合成及活性測定

2.1.1 NOTA?Herceptin的偶聯及MALDI?TOF分析 Herceptin單抗是IgG型單抗，表面含有大量裸露的氨基，具有良好的化學修飾活性.在偶聯之前使用PD?10柱以0.01 mol／L（pH＝7.4）經過Chelex 100處理的、無金屬離子的PBS純化收集，通過UV?Vis光譜測得純化后其濃度為2.57 mg／mL（17.13 nmol／L），并通過MALDI?TOF測定其分子量為148325.2.在偶聯過程中，為了保持單抗免疫活性，在4℃時，選用8.0倍摩爾數的NCS?Bz?NOTA作為雙功能螯合劑，在0.1 mol／L（pH＝8.2）NaHCO3溶液反應體系中，用HPLC的紫外分析監測反應至完成.而后用PD?10柱純化未偶聯的NCS?Bz?NOTA.即可獲得可用于放射性核素標記的NOTA?Herceptin.測定其化學濃度為1.22 mg／mL（8.13 nmol／L），通過HPLC測定其化學純度大于98％，并通過MALDI?TOF測定其實測分子量為150839.2（圖2）.偶聯前后分子量差為2514.0，雙功能螯合劑NCS?Bz?NOTA的分子量為465，因此每個單抗分子上約偶聯有5.4個NOTA分子.

Fig．2 TMALDI?TOF mass spectrum analysis of Herceptin（A）and NOTA?Herceptin（B）

2.1.2 NOTA?Herceptin的生物學活性檢測 通常，每個單抗偶聯2～5個雙功能螯合劑能夠較好地保持原有活性.偶聯前后的Herceptin的濃度通過BCA法檢測并歸一化，并通過ELISA檢測偶聯前后Herceptin不同濃度梯度下與重組HER2蛋白的特異性結合能力，結果如圖3所示.相比于偶聯前的Herceptin，NOTA?Herceptin與重組HER2蛋白抗原特異性結合能力僅在高濃度下略有下降，而總體上，偶聯前后Herceptin的效價無明顯降低，說明在研究反應體系中，NOTA?Herceptin的生物學活性可以有效保持，有利于其進一步的體內靶向成像研究.

Fig．3 Biological activity of Herceptin before（a）and after（b）NOTA modification tested by ELISA

2.264Cu?NOTA?Herceptin的質量控制及細胞攝取

2.2.1 新型核素64Cu的放射性標記64Cu既能夠進行PET診斷，又能進行核素治療.64Cu2＋外層軌道上電子的排布決定了其易于與含氮、硫、氧等原子的配體形成較穩定的配合物.在本研究中選用NOTA作為64Cu的螯合基團，與常用的DOTA相比，NOTA具有更好的穩定性［12］.

2.2.264Cu?NOTA?Herceptin的質量控制 由于單抗的分子量較大，約為1.5×105.偶聯上的核素64Cu分子量僅為64，而NOTA的分子量僅為單抗分子量的1／2000，幾乎不對單抗性質產生影響.條件優化后，放射性標記率達96％，經PD?10柱純化，獲新型分子探針64Cu?NOTA?Herceptin，Radio?HPLC測定其放化純度＞99％.

2.2.364Cu?NOTA?Herceptin的細胞攝取 為了測定修飾后64Cu?NOTA?Herceptin探針是否保持原有生物學活性劑特異性，選取HER2低表達的BGC823細胞和HER2高表達的NCI?N87細胞，測定在不同時間內的細胞攝取情況，以確定腫瘤攝取率與結合時間的關系.如圖4所示，64Cu?NOTA?Herceptin探針在HER2低表達的BGC823腫瘤細胞中的攝取隨著時間的延長而逐漸增加.在HER2高表達NCI?N87細胞中，NOTA?Herceptin在NCI?N87細胞中的攝取同樣隨時間延長而增加，且其在NCI?N87細胞中的攝取效率及攝取速度明顯比在HER2低表達的BGC823細胞中的高.而在使用Herceptin封閉HER2位點的NCI?N87細胞中（Block），2 h時的細胞攝取效率則顯著下降.這一結果說明，NOTA?Herceptin的細胞攝取是基于其與HER2受體的特異性結合，NOTA?Herceptin具有特異性的HER2受體靶向結合成像潛力.

Fig．464Cu?NOTA?Herceptin cell uptake in HER2 negative BCG823（A）and HER2 positive NCl?N87（B）（A）Uptake time／min：a.0；b.5；c.30；d.60；（B）uptake time／min：a.0；b.5；c.30；d.60；e.120；f.120（block group）.

由初步體外細胞攝取實驗結果可知，64Cu?NOTA?Herceptin探針在2種細胞中的攝取均隨著時間的延長而逐漸增加，表明該探針具有生物學活性，能夠通過細胞表面的受體轉運到細胞內部；且在HER2高表達NCI?N87細胞中的攝取速度更快，在開始（0 min）時攝取速度一致，但在5 min時為BGC823細胞攝取速度的8倍.更值得說明的是，NCI?N87細胞對NOTA?Herceptin的攝取能夠被過量的Herceptin阻斷，其具有保持HER2受體的特異性.體外腫瘤細胞攝取實驗結果表明，64Cu?NOTA?Herceptin具有生物學活性和特異性.

2.364Cu?NOTA?Herceptin的Micro?PET顯像分析

在本研究中，選右側腋下荷胃癌BGC823細胞模型的裸鼠進行Micro?PET顯像研究，腫瘤直徑約0.8 cm.如圖5所示，在尾靜脈注射7.4 MBq的64Cu?NOTA?Herceptin 4 h后，其在腫瘤部位有所富集，由于腫瘤偏大，在腫瘤內部有壞死組織，因此，在Micro?PET圖像中表現出腫瘤表面的攝取.在4 h時，64Cu?NOTA?Herceptin在心臟及肝臟中出現明顯的代謝富集.在經靜脈注射60 h后，探針在動物體內的非特異性代謝逐漸被清除，在心臟中可見少量放射性殘留，在肝臟中的攝取明顯降低.探針在BGC823腫瘤中的攝取與4 h時的相比有所提高.另外，隨著代謝時間的延長，64Cu?NOTA?Herceptin在BGC823腫瘤中表現出一定程度的富集，60 h后該探針在腫瘤部位的富集有所增加，而在心臟、腎臟的攝取逐步降低.

Fig．5 Micro?PET imaging of BGC823 tumor?bearing nude miceRed arrow indicates tumors.（A）4 h PET imaging；（B）60 h PET imaging.

Fig．6 Micro?PET imaging of human gastric BGC823 tumor?bearing nude mice（A）Sagittal，4 h；（B）coronal，4 h；（C）transverse，4 h；（D）sagittal，60 h；（E）coronal，60 h；（F）trans?verse，60 h.

為了能夠更好地了解64Cu?NOTA?Herceptin在模型動物體內的分布，通過Micro?PET進行斷層顯像分析.如圖6所示，從4 h開始，在特定的角度（橫斷面、冠狀面、矢狀面）均能夠觀察到腫瘤部位有64Cu?NOTA?Herceptin的攝取.且隨著時間延長至60 h時，腫瘤對該探針的攝取明顯增加，且探針主要分布在腫瘤的外周組織.

3 結 論

通過選用具有HER2靶向性的Herceptin單抗進行化學修飾獲得NOTA?Herceptin前體，通過ELISA檢測偶聯前后Herceptin的抗體效價變化，確認其基本保持原有活性.而后進行新型放射性診療核素64Cu的標記，獲得64Cu?NOTA?Herceptin探針并進行質量控制.該探針的細胞攝取實驗證實，標記后的探針依然保留原有的生物學活性劑特異性.而后靜脈注射64Cu?NOTA?Herceptin探針，通過Micro?PET設備觀察到其在BGC823腫瘤中表現出明顯攝取.本文研究結果表明，新型64Cu?NOTA?Herceptin探針有望用于腫瘤靶向治療的療效檢測及個體化治療.

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（Ed.：F，K，M）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.81371592，81401467，81501519，81301323，81571705）and the Natural Science Foundation of Beijing，China（Nos.7154185，7162041）.

Design and Bio?evaluation of64Cu?NOTA?Herceptin for Tumor Targeted Micro?PET Imaging?

ZHU Hua1，LI Yilin2，ZHAO Chuanke3，XIE Qinghua1，4，LIU Fei1，HAN Xuedi1，GAO Jing2，XIA Chuanqin4，SHEN Lin2?，YANG Zhi1?
（1．Department of Nuclear Medicine，2．Department of Gastrointestinal Oncology，3．Departments of Biochemistry and Molecular Biology，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education），Peking University Cancer Hospital＆Institute，Beijing 100142，China；4．College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

The precursor compound 2?（p?thiocyanatobenzyl）?1，4，7?triazacyclononane?1，4，7?triacetic acid?Herceptin（NOTA?Herceptin）was synthesized by the nucleophilic addition reaction of Herceptin and bi?func?tional chelator NCS?Bz?NOTA.The original Herceptin and NOTA?Herceptin conjugate were investigated by UV?Vis and MALDI?TOF mass spectra.The average number of chelators per Herceptin for the conjugated used in this study was 5.4.The enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to compare the biolog?ical activity of original Herceptin and NOTA?Herceptin.NOTA?Herceptin kept high immunoreactivity towards HER2 antigen.Then，the PET radio?nuclide64Cu（T1／2＝12.7 h）was labeled to got the novel tumor Immuno?Theranostics probe64Cu?NOTA?Herceptin.The labeling efficiency of64Cu?NOTA?Herceptin was tested by Ra?dio?TLC／HPLC.The radiolabeling yield was over 90％，the radio chemical purity was over 98％after PD?10 column purification and the specific activity was 185 MBq／nmol.The immune reactivity and specific activity of radiolabeled Herceptin with HER2 antigen were performed by HER2 positive NCI?N87 cell line and HER2 negative BGC823 cell line.Micro?PET imaging of BGC823 tumor?bearing nude mice revealed that tumor up?take of64Cu?NOTA?Herceptin got a gradual accumulation from 4 h to 60 h after intravenous injection of 7.4 MBq radiolabeled Herceptin.Uptake in the tumor was clearly visualized by emission computed tomography.64Cu?NOTA?Herceptin owns a great potential for molecular imaging of PET for diagnosis and follow?up of HER2 expression.

Herceptin；64Cu；Immunoreactivity；Molecular imaging；Tumor targeting therapy

O614；O628；O657.6

A

10.7503／cjcu20160593

2016?08?22.網絡出版日期：2016?11?22.

國家自然科學基金（批準號：81371592，81401467，81501519，81301323，81571705）和北京市自然科學基金（批準號：7154188，7162041）資助.

聯系人簡介：楊 志，男，博士，研究員.主要從事放射性藥物研究.E?mail：pekyz＠163.com

沈 琳，女，博士，主任醫師，主要從事消化系統腫瘤研究.E?mail：linshenpku＠163.com