鼻咽拭子EB病毒DNA檢測在鼻咽癌診斷中的價值

尤萍 方紅雁 周詩侗 倪兵

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·基礎研究·

鼻咽拭子EB病毒DNA檢測在鼻咽癌診斷中的價值

尤萍 方紅雁＊周詩侗＊倪兵

目的 探討EB病毒(EBV)-DNA檢測方法及其在鼻咽癌(NPC)早期診斷中的價值。方法 應用聚合酶鏈反應(PCR)熒光定量檢測185例疑診NPC患者鼻咽拭子及外周血EBV-DNA，并進行比較分析。185例疑診NPC患者最終病理確診為NPC 141例(NPC組)，其余44例為非NPC組。結果 2組患者鼻咽拭子EB病毒DNA檢測的陽性率均較外周血檢測的陽性率高，差異有統計學意義；鼻咽拭子EBV-DNA檢測在2組間差異有統計學意義(P<0.05)；外周血EBV-DNA檢測在2組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論 鼻咽拭子EBV-DNA檢測較外周血更為敏感，有助于NPC的早期診斷。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：385-387)

Epstein-Barr病毒; DNA; 聚合酶鏈反應; 鼻咽癌

NPC(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國最常見的惡性腫瘤之一。EB病毒( Epstein-Barr virus, EBV)感染是NPC發生的重要因素[1]，已有文獻證實EBV感染與NPC的發病關系密切[2]。然而，目前廣泛進行的血液EBV抗體及DNA檢測敏感度較低。羅耀凌等[3]報道，NPC患者Ⅰ、Ⅱ期的血EBV-DNA總陽性率僅為20%。因此，部分早期或隱匿性NPC臨床診斷往往較為困難。Jebbink等[4]利用核酸分子雜交技術和聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)熒光定量技術等檢測均表明，不同類型NPC，其組織中都存在EBV基因。為了探索一種敏感度較高的EBV-DNA檢測方法，從而指導NPC的早期診斷，本研究對我院疑診NPC患者分別行病變原發部位的鼻咽拭子及外周血PCR熒光定量檢測EBV-DNA，對檢測結果回顧比較分析如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年7月～2015年6月我院疑診NPC(鼻咽部黏膜不光滑或局部隆起或尚未查明原因的頸淋巴結腫大)患者185例，其中男性122例、女性63例；年齡21～74歲，平均50.2歲。病理確診為NPC(初診且未接受治療)的患者為NPC組，共141例，其中TNM分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期26例、Ⅲ47例、Ⅳ期59例，平均年齡為51.0歲；其余44例為非NPC組，平均年齡為47.8歲。

1.2 研究方法 EBV核酸擴增PCR熒光定量檢測試劑盒購自廣州中山大學達安基因股份有限公司，方法完全按照試劑盒操作過程。實驗標準判定也遵循試劑盒判定標準。儀器應用ABI Prism 7500熒光定量PCR儀。分別檢測2組病例鼻咽拭子及外周血中的EBV-DNA。結果>1 000拷貝/mL為陽性。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0軟件，組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

鼻咽拭子EBV-DNA總檢出率為80.0%(148/185)；外周血EBV-DNA總檢出率為24.3%(45/185)，陽性率差異有統計學意義(χ2=115.0，P<0.01)。2組患者鼻咽拭子及外周血檢測EBV-DNA的濃度范圍及中位數詳見表1。NPC組鼻咽拭子及外周血檢測陽性率差異有統計學意義；非NPC組鼻咽拭子及外周血檢測陽性率差異有統計學意義；2組鼻咽拭子檢測陽性率比較，差異有統計學意義；2組外周血檢測陽性率比較，差異無統計學意義(表2)。NPC組早期與中晚期EBV-DNA檢測陽性率比較，鼻咽拭子及外周血2種方法比較，差異均有統計學意義;同一方法早期與中晚期比較，差異均無統計學意義(表3)。

表1 EBV-DNA檢測的濃度范圍及中位數(拷貝/mL)

表2 EBV-DNA檢測陽性率[%(n/n)]

表3 NPC組早期與中晚期EBV-DNA檢測陽性率比較[%(n/n)]

3 討論

EBV感染是NPC發生的重要因素。大量研究表明，NPC患者血漿中可檢測到EBV-DNA,其復制量隨病情加重逐漸升高，且血漿EBV-DNA濃度同NPC轉移有關，有遠處轉移者拷貝數更高[5-7]。PCR熒光定量檢測EBV-DNA對NPC的診斷、治療方案的選擇、療效判定及預后意義重大[8]。然而，臨床上我們發現外周血EBV-DNA檢出率普遍較低。本研究中，所有疑診NPC患者EBV-DNA檢測，外周血總陽性率為24.3%，而鼻咽拭子的總陽性率為80%，鼻咽拭子的陽性拷貝濃度遠高于血液標本，特別是NPC組，外周血陽性率為27.7%，而鼻咽拭子陽性率為95.0%。因此，鼻咽部病變原發部位EBV-DNA檢測較外周血更為敏感。

在非NPC組，鼻咽拭子及外周血EBV-DNA陽性率差異同樣存在統計學意義。但該組患者數量較少，且未進行嚴格分類，混雜了淋巴瘤、淋巴結反應性增生及鼻咽炎患者，而EBV感染與咽淋巴環非霍奇金淋巴瘤的發生關系密切[9]，很多淋巴結反應性增生及鼻咽炎患者亦本身存在EBV感染。因此，鼻咽拭子或血EBV-DNA檢測陽性同樣存在于伴有EBV感染的其他非NPC患者，但本組患者2種方法比較，P<0.05，且EBV復制的拷貝數相對較低。由于本研究為回顧性分析，因獲得正常成人的血液及鼻咽拭子EBV-DNA檢測結果存在費用及研究對象配合問題，目前缺乏正常成人的陰性對照，為研究中的不足。然而，NPC組與非NPC組鼻咽拭子EBV-DNA檢測陽性率比較，差異有統計學意義，而2組外周血EBV-DNA陽性率比較，差異無統計學意義，因此，鼻咽拭子EBV-DNA檢測的特異性較外周血高?？梢?，即便本研究中的非NPC組混雜了同樣與EBV感染相關的非霍奇金淋巴瘤等疾病，2組間的差異亦有統計學意義。鼻咽拭子EBV-DNA檢測在NPC中的特異性高于其他鼻咽原發性疾病。在NPC組，早期(Ⅰ期+Ⅱ期)或中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)患者鼻咽拭子與外周血2種方法比較，差異均有顯著統計學意義，而鼻咽拭子EBV-DNA檢測，早期與中晚期比較，差異無統計學意義，提示無論早期還是中晚期鼻咽部EBV-DNA均存在高表達。而外周血EBV-DNA檢測，無論NPC組與非NPC組比較，還是早期與中晚期比較，差異無統計學意義，提示外周血EBV-DNA檢測特異度極差。因此，鼻咽拭子EBV-DNA檢測對NPC的診斷，特別是活檢困難的早期或隱匿性NPC的診斷有較好的指導意義。若鼻咽拭子EBV-DNA檢測濃度較高，即便無法病理確診NPC的患者，亦應嚴密隨訪鼻咽鏡及EBV-DNA濃度的變化以追蹤病情進展。

然而，NPC組和非NPC組比較，外周血陽性率差異無統計學意義，且陽性拷貝濃度差異亦不大，而鼻咽拭子陽性率差異有顯著統計學意義，且陽性拷貝濃度差異甚大。有研究[10]報道，對于NPC患者，鼻咽上皮細胞的EBV感染是癌變過程中侵襲前的變化，幾乎100%的NPC活檢組織中存在EBV的基因，且復制的拷貝數目較多。EBV主要分布于鼻咽上皮中，僅少數分布于外周血白細胞。該研究結果亦證實，在NPC或其他EBV感染相關的鼻咽部病變中，病變原發部位的鼻咽拭子EBV-DNA檢測均較外周血更敏感，其對鼻咽部病變的診斷有較大的幫助，且鼻咽拭子標本采集方便，也易于臨床應用。當然，最終確診還是依靠病理診斷。

此外，有文獻[11]報道，放療前的NPC患者血漿EBV-DNA濃度上升，治療后的NPC患者血漿EBV-DNA濃度迅速下降，治療后再復發者血漿EBV-DNA濃度迅速又回升。龔曉昌等[12]研究表明，并非所有EBV-DNA陽性的NPC患者均被發現復發或轉移，但這些患者有近40%將在隨后的2～10個月內被診斷為復發或轉移。另有其他研究[13]亦認為，NPC患者血漿EBV-DNA水平是反映腫瘤負荷的靈敏指標,可作為療效評估的參考，其在檢測NPC的復發和轉移中有重要的意義。我們在臨床觀察中發現，NPC患者經過放療后部分患者鼻咽拭子EBV-DNA濃度迅速下降或消失，而少數患者鼻咽拭子EBV-DNA濃度下降并不明顯，其是否反映NPC局部控制情況，鼻咽拭子EBV-DNA濃度變化的監測對預后的判斷是否具有指導意義，尚需進一步的臨床隨訪觀察及總結。

[1] Beier UH, Gurogh T. Implications of galactocerebrosidase and galactosylcerebroside metabolism in cancer cells[J]. Int J Cancer, 2005,115(1):6-10.

[2] Wille CK, Nawandar DM, Panfil AR, et al. Viral genome methylation differentially affects the ability of BZLF1 versus BRLF1 to activate Epstein-Barr virus lytic gene expression and viral replication[J]. J Virol,2013,87(2):935-950.

[3] 羅耀凌,陳浩,彭頌國.聯合檢測EB病毒不同抗體及EBV-DNA在NPC血清學診斷中的價值[J].中華醫學雜志,2013,93(44)：3516-3519.

[4] Jebbink J, Bai X, Rogers BB, et al. Development of real-time PCR assays for the quantitative detection of Epstein-Barr virus and cytomegalovirus, comparison of TaqMan probes, and molecular beacons[J].J Mol Diagn, 2003，5(1):15-20.

[5] Ma BB, King A, Lo YM, et al. Relationship between pretreatment level of plasma Epstein-Barr virus DNA, tumor burden, and metabolic activity in advanced nasopharyngeal carcinoma [J].Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 66 (3):714-720.

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[7] Cai MB, Han HQ, Bei JX, et al. Expression of human leukocyte antigen G is associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma [J].Int J Biol Sci, 2012, 8(6):891-900.

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[9] 陶雪勤，梅金紅，張振東,等.咽淋巴環非霍奇金淋巴瘤與EB病毒感染的關系[J].廣東醫學,2009,30(11):1669-1671.

[10] Hislop AD, Taylor GS, Sauce D, et al. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus[J].Annu Rev Immunol,2007,25(1):587-617.

[11] 黃遠見,羅志強,賈文輝.NPC患者放化療前后外周血裝EBV-DNA含量變化[J].中國眼耳鼻喉科雜志,2009,9(6)：353-355.

[12] 龔曉昌，李金高，袁霞，等.血漿EBV DNA水平測定在監測NPC放療后復發、轉移中的臨床意義[J].實用癌癥雜志，2007, 22(2):150-153.

[13] Silva JM, Garcia JM, Dominguez G, et al. Persistence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients after mastectomy[J]. Ann Surg Oncol，2002，9(1):71-76.

(本文編輯 楊美琴)

Value of Epstein-Barr virus DNA detection in nasopharyngeal swabs for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

YOUPing,FANGHong-yan＊,ZHOUShi-tong＊,NIBing.

TumorMolecularandCellularBiologyExperimentCenter,theThirdPeople’sHospitalofHonghe,Gejiu661000,China

ZHOU Shi-tong, Email: zst8476@163.com

Objective To explore the detection method of Epstein-Barr virus (EBV)-DNA and its value in the early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Methods Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the EBV-DNA both in the nasopharyngeal swab and in the peripheral blood in 185 patients suspected as nasopharyngeal carcinoma, in which 141 cases were pathologically diagnosed as NPC(NPC group) and the other 44 cases as non NPC (non NPC group). Results The objective rate of EBV DNA detected in nasopharyngeal swabs was higher than that in peripheral blood both in NPC group and in non NPC group. However, EBV was highly expressed in nasopharyngeal swabs than in peripheral blood in nasopharyngeal swabs (P<0.05), while the difference of the objective expression of EBV-DNA between the two groups was not significant in peripheral blood (P>0.05). Conclusions It’s more useful for the early diagnosis of NPC to detect EBV in nasopharyngeal swabs than in peripheral blood. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:385-387)

Epstein-Barr virus; DNA; Polymerase chain reaction; Nasopharyngeal carcinoma

云南省紅河哈尼族彝族自治州第三人民醫院腫瘤分子與細胞生物學實驗中心 個舊 661000；＊重慶市人民醫院(三院院區)耳鼻咽喉頭 頸外科 重慶 400014

周詩侗(Email：zst8476@163.com)

現在重慶市婦幼保健院檢驗科 重慶 400013

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.06.003

2015-10-26)