小葉章組培快繁體系的研究

張 玉, 倪紅偉， 隋 心,2， 徐明怡， 冷海楠

(1.黑龍江省科學院 自然與生態研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

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小葉章組培快繁體系的研究

張 玉1, 倪紅偉1， 隋 心1,2， 徐明怡1， 冷海楠1

(1.黑龍江省科學院 自然與生態研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

以野生小葉章幼嫩莖段為外植體，研究MS對外植體生長的影響。通過正交試驗設計，研究不同種類及濃度配比激素對叢生芽增殖和生根的影響。表明小葉章莖段用75%酒精消毒30 s，再經0.01 L汞溶液浸泡4 min的滅菌效果較好；莖段直接誘導不定芽的最適宜培養基為MS+0.05 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L+TDZ 0.1 mg/L NAA，誘導率可達87.44%；最佳繼代增殖培養基為MS+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，增殖系數可達5.76；生根最適宜培養基為0.5MS+2.0 mg/L NAA，生根率為93.33%。

小葉章； 莖段； 組織培養； 快速繁殖

0 引 言

小葉章(CalamagrostisangustifoliaKom.)是禾本科拂子茅屬多年生根莖型草本植物，我國主要分布于東北、華北、內蒙古等地的平原低洼濕地，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優勢植物[1-4]。小葉章具有重要的經濟價值和生態價值,例如在東北草地地區其飼用價值僅次于羊草，同時它也是很好的水土保持植物和造紙等輕工業的良好原料[5]。近年來，由于三江平原大量濕地開墾成農田，使得濕地生態系統遭到嚴重破壞，濕地生物多樣性降低，小葉章的種群受到嚴重的破壞，生態功能下降。因此，對小葉章的人工繁殖可以減少對野生資源的破壞，對于研究小葉章生理學、分子生物學具有重要的意義。

目前，對于小葉章的研究主要集中在種群特征[6-7]、生長動態[8]、溫室氣體排放[9]及土壤物質循環等方面[10]，而關于小葉章的離體培養研究目前為止還沒有，僅有同屬的拂子茅是以莖尖為外植體材料，誘導獲得愈傷組織，然后愈傷組織再分化成芽的方式進行的[11]。而利用植物離體器官直接再生不定芽具有培養時間短，不容易發生變異等優點[12-13]。鑒于此，本研究以小葉章幼嫩莖段為外植體，按正交試驗設計篩選組織培養條件，通過直接誘導不定芽、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過程，從而建立小葉章的組織培養和快速繁殖體系，為小葉章的資源保護、基因工程研究提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小葉章采自黑龍江省科學院自然與生態研究所三江平原濕地生態定位研究站——洪河國家級自然保護區內(47°49′N， 133°40′E，年均氣溫1.9 ℃，年均降水量500～650 mm)。選取當年新生無病蟲害、生長健壯的幼嫩莖段作為外植體。本試驗室內研究部分在黑龍江省科學院自然與生態研究所分子生物學實驗室的組織培養實驗室進行，擴繁部分在本所溫室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基條件

以MS為基本培養基，添加蔗糖30 g/L和瓊脂6 g/L，調整pH 5.5～5.8，配制分裝后于121 ℃滅菌20 min。培養溫度(25±2)℃，光照強度3 000 lx，光照16 h/d。

1.2.2 外植體處理

將采集的莖段去除葉片后，剪成4～6 cm長的莖段，用自來水沖洗10 min左右，再用適量的洗潔精水沖洗2遍，自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2次；用0.1%HgCl2溶液消毒2、4、6、8、10、15 min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，于消毒過的濾紙上切除上下切口處的褐化部分，將材料切成1.5～2.0 cm、帶1或2個葉腋的莖段并吸干莖段上的水分，接種于初代培養基上。比較0.1%HgCl2不同消毒時間的滅菌效果，7 d后觀察污染情況，14 d后統計污染率、成活率。

污染率(%)=(污染數/接種數)×100%

成活率(%)=(芽誘導直接成苗率/接種未污染芽數)×100%

1.2.3 初代培養

將消毒好的小葉章帶腋芽莖段接種在初代誘導培養基MS，同時添加不同種類和濃度的激素。按照表1設計正交實驗的因素和水平，采用L16(45)正交表設計初代誘導培養基(見表2)。每瓶一個莖段，每個處理接種30瓶，重復3次。4周后,腋芽萌發并伸長生長形成綠梢，獲得的這些無菌苗用于進一步進行增殖實驗的材料。

腋芽誘導率(%)=(萌芽的外植體數/接種外植體總數)×100%

表1 正交試驗的因素和水平 mg/L

表2 按正交表設計的培養基配方 mg/L

1.2.4 繼代增殖

采用L16(45)正交實驗設計，以MS為基本培養基，設置KT(0.05，0.1 mg/L)、6-BA(0.1，0.5 mg/L)、TDZ(0.05，0.1 mg/L)、NAA(0.1，0.2 mg/L)四因素二水平共8個處理。每處理10瓶，每瓶接種1個芽叢，重復3次。培養30 d后統計增殖系數=培養30 d后的總芽數/接種時的芽數，并記錄增殖芽生長情況。

1.2.5 生根培養

以0.5MS作為生根培養基，當繼代苗長到約2 cm高、具2～4片小葉時，將植株從基部剪下，轉接至添加不同濃度(0，0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L)的NAA生根培養基中，每瓶接種1個莖段，每個處理10瓶，重復3次，并計算生根率和平均每株根數。

1.2.6 數據分析

實驗結果采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.5分析軟件對試驗數據進行處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 外植體的消毒處理

從表3可以看出,隨著0.1% HgCl2消毒時間的增加，外植體污染率下降，而成活率先升后降，4 min時達到最高，71.6%，當消毒15 min時，外植體全部死亡，所以升汞溶液消毒的適宜時間為4 min。

表3 消毒時間對小葉章莖段滅菌效果的影響

2.2 初代培養

從表4可以看出，小葉章莖段在不添加植物生長調節劑的MS培養基中，莖段腋芽不萌發。在添加不同植物生長調節劑培養基上的誘導率為5.56%～87.44%。其中8號培養基上芽誘導率最高，為87.44%，培養效果較好(圖1(b))；其次是7號培養基,誘導率為59.89%。從各因素水平均值k的大小，比較四因素各水平求得最優水平組合仍為8號培養基；由R值大小可知，各因素不同水平對小葉章莖段腋芽誘導率的影響大小為：KT>TDZ>6-BA >NAA。對誘導率反正弦轉換值方差分析(見表5)，結果表明，KT、TDZ、6-BA和NAA濃度對小葉章莖段腋芽誘導率都有顯著影響(P<0.05)，且8號培養基與其他培養基的差異顯著(見表4)。

2.3 繼代增殖

將初代培養的腋芽切下接到繼代增殖培養基中，由表6可以看出，影響增殖系數的主要因素是6-BA>KT>NAA>TDZ。由方差分析表7可知，除了TDZ對小葉章的增殖影響不顯著(P>0.05)外，KT、6-BA、NAA對增殖系數的影響均達到顯著水平。綜合以上因素，7號培養基為最佳。

表4 不同植物生長調節劑對小葉章莖段初代培養的影響

注：K1、K2、K3、K4分別代表不同水平 4次誘導率之和；kl、k2、k3、k4分別代表不同水平均值誘導率；R代表平均極差(R=最大均值-最小均值), 同一列中不同字母表示數據差異顯著(P<0.05)

表5 正交設計方差分析表(完全隨機模型)

2.4 生根培養

由表8可見，不同濃度NAA對小葉章組織培養苗生根率的影響顯著，其中，0.5MS+2.0 mg/L NAA培養基上培養30 d后，生根率最高，達到93.33%，根多且粗壯，植株生長健壯(圖1(g))。

表6 正交試驗不同培養基小葉章的增殖系數

(a) 剛接種的無菌外植體，(b) 莖段腋芽萌發，(c)、(d) 增殖培養，(e)、(f) 芽苗生根，(g)、(h) 生根苗移栽

表8 不同NAA濃度對小葉章生根培養的影響

3 討 論

在植物組織培養中，外植體無菌體系的建立是很關鍵的一步。其中，適當的消毒時間和合適的消毒劑是非常重要的。本試驗選取當年生長健壯的小葉章幼嫩莖段為外植體，在預試驗中發現，使用2%的次氯酸鈉消毒效果較差，污染率極高。而使用0.1%的升汞，污染率大幅降低，成活率較高，這與張娟等[11]在拂子茅莖尖作為外植體中的研究基本相似。所以，本試驗中篩選出最佳的消毒處理方案為75%酒精30 s+0.1% HgCl24 min，該條件下植株成活率最高。

在植株分化過程中，通過調節生長素和細胞分裂素的比值，能調控植物細胞的生長和定向分化[14]。對大多數植物來說，為了達到腋芽萌發或者芽增殖的目的，采用一定濃度的單一細胞分裂素和生長素，就可以得到較好的效果。孫清榮等[15]在歐洲李的組織培養與快速繁殖中發現MS+BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L增殖效果較好，紅歌等[16]在單頭亞菊組培快繁技術研究中提出MS+0.75 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，的組合就能得到較高的增殖率，但在小葉章組培試驗中，用單一的細胞分裂素，分化率低，筆者猜測只有用一定濃度兩種或兩種以上的細胞分裂素結合較低濃度的生長素，才有可能找到最佳分化配方。因此，本試驗采用6-BA、KT、TDZ及NAA組合試驗，結果表明，MS+KT0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L為最適外植體誘導培養基，誘導率達87.44%。

在生根培養過程中發現，生根培養基中適量降低無機鹽的濃度能有效促進生根，因此，采用1/2MS作為基本培養基，小葉章的生根效果更好，這與王雪芳[17]，趙智燕[18]在小花堿茅和高羊茅生根試驗中的結果相一致。預試驗中發現，單獨使用IBA不能使小葉章組培苗生根，在培養基中加入2.0 mg/L的NAA后，生根效果最好，生根率明顯提高，這與吳玲利等[19]在白木通生根過程中的研究相一致，說明NAA對小葉章的生根有明顯的促進作用。

4 結 語

本研究通過小葉章組培快繁各個階段最佳培養基的篩選，建立穩定而高效的小葉章組織培養與快速繁殖體系，為小葉章的遺傳改良提供技術支持，有利于促進小葉章基因工程的深度開發。

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Tissue Culture and Rapid Propagation of Calamagrostis Angustifolia

ZHANGYu1,NIHong-wei1,SUIXin1,2,XUMing-yi1,LENGHai-nan1

(1. Institute of Natural Resources and Ecology, HAS, Harbin 150040, China; 2. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

In order to provide experimental and technological basis for Calamagrostis Angustifolia community propagation, protection and sustainable development, this study explored the techniques of in vitro propagation of Calamagrostis Angustifolia using stem segments, and MS(as basal medium) to find the most suitable time for surface sterilization of explants. The effects of different plant growth regulators on buds multiplication and root formation were studied by orthogonal design method. It found that the best sterilization method for Calamagrostis Angustifolia was to soak explants into 75% alcohol for 30s and 0.1% HgCl2 for 4 min after pretreatment. The best medium for the buds induction was MS+KT0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L, by which the induction rate was 87.44%; the optimal medium for subculture was MS+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA, by which the multiplication coefficient was 5.76; the best rooting medium was 1/2MS+2.0 mg/L NAA, by which the rooting rate was 93.33%.

Calamagrostisangustifolia; stems; tissue culture; rapid propagation

2015-11-23

國家自然科學基金項目(No.31470019)；黑龍江省財政應用技術專項(STJB16-01)；黑龍江省科學院創新基金資助項目

張 玉(1983-)，女，黑龍江東寧人，碩士, 助理研究員,主要從事分子生態方向研究。

Tel.：15124502196；E-mail：lengning1029@126.com

倪紅偉(1964-)，男，黑龍江雙城人，博士，研究員，主要從事濕地生態學研究。E-mail: nihongwei2000@163.com

Q 938

A

1006-7167(2016)08-0047-05