山苓祛斑凝膠劑提取物質量標準研究

陳軍++舒祥++余南才

【摘要】目的：建立山苓祛斑凝膠的質量標準。方法：運用HPLC法測定祛斑凝膠提取物中尿囊素、阿魏酸含量作為評價指標，流動相分別為乙腈-0085%磷酸-水（5∶95）、（17∶83），流速為05mL/min、1mL/min，柱溫30℃，檢測波長為224nm、316nm。結果：尿囊素、阿魏酸線性范圍0368～2208μg、0424～2544μg，精密度RSD 055%、092%，穩定性RSD 14%、15%，重復性RSD 095%、055%。祛斑凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量分別為112mg/g、45mg/g。結論：該方法重復性好，質量可控，可為該凝膠制劑進行中試、生產提供參考。

【關鍵詞】山苓祛斑凝膠；含量測定；高效液相色譜法

【中圖分類號】R2841【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）21-0011-03

黃褐斑也稱“肝斑”、“蝴蝶斑”，為面部黃褐色色素沉著，且多對稱蝶形分布于頰部，大小不一、形態不定，好發于育齡期女性[1]。黃褐斑由多種因素綜合作用導致，其發病與妊娠、長期口服避孕藥、月經紊亂有關，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚無徹底治愈方法，臨床治療方法有一定的副作用，如造成外源性褐黃病、皮膚萎縮、永久性脫色，甚至出現腎毒性、精神、神經癥狀等，因而黃褐斑一直是醫學界關注的問題。中醫藥治療黃褐斑有著悠久歷史，具有一定優勢。中藥凝膠劑是一種新型外用制劑，適用于皮膚、黏膜及腔道，不僅避免口服給藥存在的胃腸道內酶、酸等首過作用，而且可減輕藥物不良反應，同時具有使用方便、舒適、生物相容性好等多種優點，臨床上治療黃褐斑已取得較好療效[2-4]。復方中藥山苓祛斑方為我院中醫部周利副主任醫師經驗方，由山藥、茯苓、白芷、白及、當歸等藥組成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作為凝膠劑質量標準[5-6]，用HPLC法測定凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量，為其質量控制提供實驗依據。

1儀器與材料

1.1儀器DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（紫外DAD檢測器，美國DIONEX公司）；CP 2104 電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）。

1.2材料山藥、茯苓、當歸等9味中藥材飲片（亳州國一堂中藥飲片有限公司），祛斑凝膠劑（批號：20150401、20150405、20150410，自制）；凝膠劑陰性樣品（自制不含當歸及山藥的樣品各一份，批號20150410），尿囊素（批號：111501-200001）、阿魏酸對照品（批號：110773-200611）、茯苓（批號：121117-201302）、當歸（批號：120927-201408）、山藥（批號：121137-201405）等對照藥材購于中檢所，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2方法

2.1祛斑凝膠提取物中尿囊素含量測定

2.1.1色譜條件ODS C18色譜柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.085%磷酸水（5∶95）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：224nm；進樣量：10μL。

2.1.2對照品溶液制備精密稱取尿囊素對照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超純水稀釋至刻度。

2.1.3供試品溶液制備稱取山苓祛斑凝膠提取物3g，加入適量甲醇超聲溶解，加入100-200目硅膠4.5g，蒸干溶劑后進行硅膠柱色譜分離。硅膠用量為50g （300～400目），洗脫劑選擇二氯甲烷∶甲醇（9∶1），收集200mL，濃縮后用甲醇稀釋至10mL，作為供試品溶液。

2.1.4陰性對照溶液制備按處方量制備除山藥外的所有組分的凝膠劑，作為山藥陰性對照樣品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5線性關系考察分別進樣2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg線性關系良好。

2.1.6精密度試驗精密吸取供試品溶液10μL，連續進樣6次，記錄峰面積積分值，結果表明：精密度良好，平均峰面積為15.5925，RSD為0.55%。

2.1.7穩定性試驗精密吸取尿囊素標準品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 進樣1次，記錄峰面積積分值，結果表明：尿囊素標準品穩定性良好，RSD為1.4%。

2.1.8重復性試驗取同一批凝膠劑6份，按尿囊素供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進樣6次，計算尿囊素平均含量為4.5mg/g，RSD為0.95%，表明該方法重復性良好。

2.1.9加樣回收率試驗稱取山苓祛斑凝膠提取物1.5g，分別加入尿囊素對照品溶液15μL，按照供試品溶液制備的方法處理，進樣10μL，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算尿囊素標準品的加樣回收率為97.2%，RSD為1.2%。

2.1.10尿囊素含量測定精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算得出尿囊素含量為4.5mg/g。

2.2山苓祛斑凝膠提取物中阿魏酸含量測定

2.2.1色譜條件ODS C18色譜柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（17：83）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：316nm，進樣量：10μL。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對照品，加甲醇制備成濃度為0.212μg/μL的溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取山苓祛斑凝膠提取物10g，加甲醇超聲，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4陰性對照溶液制備按處方量制備除當歸外的所有組分的凝膠劑，作為當歸陰性對照樣品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5線性范圍考察分別精密吸取阿魏酸對照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積和進樣量求得回歸方程y=1.2937x +0.3404， R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好線性關系。

2.2.6精密度實驗精密吸取對照品溶液10μL，重復進樣6次，測得峰面積，其RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩定性試驗精密吸取阿魏酸標準品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 進樣1次，記錄峰面積積分值，結果表明：阿魏酸標準品穩定性良好，RSD為1.5%。

2.2.8重復性試驗取同一批凝膠劑6份，按阿魏酸供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣6次，計算阿魏酸平均含量為11.4mg/g，RSD為0.55%，表明該方法重復性良好。

2.2.9加樣回收率實驗精密量取兩份1mL樣品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸對照品溶液，定容至50mL，測得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%。

2.2.10阿魏酸含量測定精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算得出阿魏酸含量為11.2mg/g。

2.3山苓祛斑凝膠劑TLC定性鑒別按2015版《中國藥典》一部及附錄（0502）薄層色譜法對祛斑凝膠劑中山藥、當歸及茯苓進行TLC定性鑒別[7]，供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

按文獻[8]對山苓祛斑凝膠劑中的尿囊素進行薄層鑒定：取山苓祛斑凝膠劑10g，加入適量甲醇超聲溶解，溶解后吸取10μL點于硅膠GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇（1∶8∶1∶1∶2）為展開劑，15%的對二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液為顯色劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同黃綠色斑點，且陰性樣品無干擾。

3討論

3.1波長選擇經紫外光譜掃描，測得尿囊素在224nm處有最大吸收，阿魏酸在316nm處有最大吸收，故本文分別選擇224nm作為尿囊素的檢測波長，316nm作為阿魏酸的檢測波長。

3.2流動相的選擇原有用甲醇-水（1∶9）測定尿囊素含量，實驗發現其分離效果不好，分離度不能達到分析要求；甲醇

-磷酸二氫鉀緩沖液（2∶98）比例的極性太大，而純水對色譜柱的損害較大。經摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水

（5∶95） 作為流動相，基本能夠達到較好的分離效果，尿囊素出峰時間大約在5.5min左右。重復性試驗RSD為0.95%，加樣回收試驗測得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%也表明在此色譜條件下尿囊素的分離效果較為滿意。

研究通過測定山苓凝膠劑中尿囊素和阿魏酸的含量，初步確定了山苓凝膠劑的質量控制方法。所建立的方法簡單，準確，分離度與重現性均好，可以用于控制山苓凝膠劑的質量。

參考文獻

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（編輯：陶希睿）