石榴4-香豆酸輔酶A連接酶基因的克隆和表達分析

董麗麗，阿不都熱扎克·依沙克,戶 倩，李川微，張水明*

(1 安徽農業大學 園藝學院，合肥 230036; 2 中國農業大學 觀賞園藝與園林系，北京 100193)

石榴4-香豆酸輔酶A連接酶基因的克隆和表達分析

董麗麗1，阿不都熱扎克·依沙克2,戶 倩1，李川微1，張水明1*

(1 安徽農業大學 園藝學院，合肥 230036; 2 中國農業大學 觀賞園藝與園林系，北京 100193)

4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)是木質素合成途徑的關鍵酶。該研究以‘紅玉石籽’ (Punicagranatumcv. Hongyushizi)石榴為試驗材料，采用RACE和RT-PCR方法獲得4CL同源基因Pg4CL。Pg4CL基因cDNA全長2 121 bp，編碼544個氨基酸；序列比對和功能域分析發現，Pg4CL包含有2個保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG；系統進化樹分析顯示，Pg4CL與其他物種起源相同，而與赤桉 Ec4CL親緣關系最近。熒光定量PCR分析表明，Pg4CL基因在葉、果皮、種皮和莖等組織中均有表達，其中果皮和葉片中表達量較高，種皮中表達量最低；Pg4CL基因在6個石榴品種的種皮中均有表達，其中在‘突尼斯軟籽’中表達較高，‘會理軟籽’表達量最低；Pg4CL基因在‘紅玉石籽’籽粒的不同時期均有表達，在15～60 d相對表達量逐步上升，并在 60 d時達到最高；75 d以后表達量急劇下降，僅維持較低水平表達。

石榴；4CL；基因克??；表達分析

石榴 (PunicagranatumL.)果實富含糖類、有機酸、礦物質和多種維生素[1]，具有抗癌及降血脂等保健功能[2]。然而，石榴種皮結構中通常含有較高的能夠增強細胞機械支持力、加大細胞壁硬度的木質素[3]，從而導致籽粒硬度增加，降低了石榴果實的可食率。因此，降低石榴籽粒中的木質素含量，能夠有效降低籽粒的硬度，提高石榴的可食率。

根據單體的不同，可將木質素分為3種類型：愈創木基木質素(guaiacyl lignin，G-木質素)、對-羥基苯基丙烷木質素(p-hydroxyl-phenyl lignin，H-木質素)和紫丁香基木質素(syringyl lignin，S-木質素)[4]。生成G-木質素的苯丙烷類代謝途徑是木質素合成途徑的重要組成部分。4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)能夠催化4-香豆酸生成肉桂酰輔酶A，是苯丙烷類代謝途徑的重要調控位點，其功能研究備受重視。目前4CL基因已在大豆[5]、火炬松[6]、煙草[7]、美洲山楊[8]、擬南芥[9]、苔蘚[10]、柳枝稷[11]、水稻[12]、碭山酥梨[13]等多個物種中被鑒定。美洲山楊中含有2個4CL基因，二者表達特性及功能均不同。其中Pt4CL1在木質化的組織中表達，而Pt4CL2在莖和葉的表皮層中表達。Pt4CL1參與木質素的合成，Pt4CL2參與類黃酮的合成。抑制Pt4CL1的表達，楊樹的木質素含量下降45%[8]。Li等將反義4CL基因轉化美洲山楊，木質素含量下降40%[14]。Zhao等將毛白楊反義4CL基因導入煙草，導致轉基因煙草中木質素含量平均下降10.3%，最高達18.9%[15], 而抑制內源4CL基因的表達可使木質素含量下降41.73%[16]。反義4CL轉化擬南芥，導致G-木質素含量下降30%[17]。抑制Os4CL3的表達引起了水稻木質素含量的顯著降低[12]。利用RNAi降低4CL蛋白的活性導致柳枝稷中木質素含量的降低[11]，而將35S啟動子融合4CL基因轉化煙草，導致葉片中木質素含量增加20%，莖部木質素含量增加25%[18]。以上研究說明改變4CL基因的表達量能夠引起木質素含量的顯著變化，因此，4CL基因在利用基因工程手段調控木質素的合成中具有較大的應用潛力。

本研究從石榴中克隆了4CL同源基因Pg4CL, 并采用實時熒光定量PCR對該基因在不同石榴品種、不同組織、不同籽粒發育階段的表達水平進行了檢測。為進一步研究Pg4CL的功能奠定基礎，也為軟籽石榴新品種培育提供基因儲備。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

石榴品種均采自安徽農業大學農業園石榴種質資源圃。采集‘紅玉石籽’[19]、‘白玉石籽’、‘粉皮’、‘會理軟籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯軟籽’成熟度一致的果實，將籽粒剝離出，去除假種皮、種仁，僅留下種皮部分，浸于液氮中帶回實驗室，儲存于-80 ℃冰箱中備用；采集‘紅玉石籽’品種的花、嫩莖、果實、葉片，并將花、嫩莖、葉片浸于液氮中帶回實驗室，儲存于-80 ℃冰箱中備用；分別采集 15、30、45、60、75和90 d 的‘紅玉石籽’果實，同上所述，將種皮部分帶回實驗室，儲存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因全長序列的克隆 以‘紅玉石籽’的種皮為材料，采用Trizol方法提取總RNA。使用超微量紫外分光光度計檢測RNA的質量，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。 選取OD260/OD280> 1.70，且無降解的RNA為模板，使用MMLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA。根據已構建的石榴籽粒EST庫中Pg4CL的部分序列，設計下游引物4CL-5GSP1和4CL-5GSP2，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit獲得Pg4CL的5端序列。

表1 本研究中使用的引物

將兩部分序列進行拼接，并設計引物4CL-F/4CL-R進行擴增，最終獲得Pg4CL基因的全長序列。使用PrimerSTAR HS聚合酶擴增Pg4CL，加A后連接到pGEM-Teasy載體，由上海生工公司進行測序。

1.2.2 基因表達分析 根據Pg4CL的全長序列，設計引物4CL-RT-F/4CL-RT-R。采用Trizol方法提取不同組織的RNA，使用DNase I進行消化，去除殘留DNA。分別取2 μg處理后的RNA，利用MMLV反轉錄酶進行反轉錄，獲得cDNA模板。按照SYBR?Premix Ex TaqTMII的操作步驟，反應體系為：10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL ROX Peference Dye，0.8 μL上游引物4CL-RT-F (10 μmol/L)，0.8 μL下游引物4CL-RT-R (10 μmol/L)，2 μL模板，6.4 μL dH2O，總體系為20 μL。反應程序如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。使用ABI 7500 Fast實時PCR系統進行熒光定量PCR。石榴PgACTIN作為內參基因, 數據分析使ABI7500軟件(Version 2.0.4), 相對表達量的計算使用2-ΔΔCT方法[20]。

1.2.3 序列分析、系統進化樹的構建及數據分析 序列分析、系統進化樹的構建及數據分析均參考張水明等的方法[21]。

2 結果與分析

2.1 石榴Pg4CL基因全長cDNA克隆與序列分析

根據石榴籽粒EST庫中已獲得的Pg4CL基因片段(GenBank登錄號JZ123116.1)，設計引物4CL-5GSP1和4CL-5GSP2進行5′-RACE擴增，獲得片段大小為247 bp序列(圖1)。將5′片段與已知片段拼接，設計引物4CL-F和4CL-R進行擴增，獲得2 121 bpPg4CL基因序列(圖1)，其中包含5′非編碼區168 bp，3′非編碼區318 bp和開放閱讀框1 635 bp。該基因編碼一個含有544個氨基酸的蛋白質。利用ExPaSy ProtPara在線工具預測分子量為59.7 kD，理論等電點為5.65。

2.2 石榴Pg4CL的同源性分析

將Pg4CL基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進行比對，發現Pg4CL與赤桉的 Ec4CL蛋白相似性最高(圖 2)，達到82.35%。與忍冬和矮牽牛相似性分別為77.39%和78.13%。Pg4CL氨基酸序列上存在2個保守域, 即SSGTTGLPKGV和GEICIRG(圖 2), 其中SSGTTGLPKGV在所有已知的4CL基因中都存在，被認為是假定的AMP結合域[5，22]。GEICIRG被認為與4CL及相關蛋白的穩定性和催化活性有關[23]。

2.3 Pg4CL同源蛋白系統發育分析

為了確定Pg4CL與其他物種4CL的親緣關系，利用MEGA5.05軟件，將Pg4CL與已克隆的東方山羊豆、紫穗槐、杧果等15個物種中的4CLs進行多重序列比對和系統進化分析(圖4)。結果顯示，Pg4CL與其他物種的4CL起源相同，確實是4CL家族的同源基因。但在后來進化的不同時期，與其他物種分離開來。Pg4CL和赤桉Ec4CL的親緣關系最近，聚為一枝，而與菘藍It4CL和大豆Gm4CL親緣關系較遠。

2.4 不同組織中Pg4CL基因的表達分析

以品種‘紅玉石籽’為材料，對石榴不同組織中Pg4CL基因表達水平進行檢測。結果表明：Pg4CL基因在葉、果皮、種皮和莖等組織中均有表達。其中, 果皮和葉片中的表達量較高，而種皮中的表達量較低，僅為葉片中的1/5(圖3)。

2.5 不同石榴品種中 Pg4CL基因表達

為探討不同石榴品種中Pg4CL基因的表達水平，利用熒光定量PCR對種皮中Pg4CL基因的相對表達量進行檢測。 結果表明:Pg4CL基因在不同品種石榴種皮中均有表達，以‘紅玉石籽’作為對照，‘突尼斯軟籽’中表達較高，‘會理軟籽’表達量最低(圖 5)。這與6個品種間木質素含量趨勢(‘紅玉石籽’=‘白玉石籽’>‘粉皮’>‘會理軟籽’>‘蒙自甜’>‘突尼斯軟籽’)并不相同[24]，這可能是由于不同品種間木質素的含量由多個因素共同調控，如基因、激素等。

2.6 不同發育時期Pg4CL基因的表達

為揭示Pg4CL基因在籽粒不同發育時期的表達特性。分別對開花后15、30、45、60、75和90 d 的‘紅玉石籽’籽粒進行取樣檢測。結果表明:Pg4CL在籽粒的不同時期均有表達，整體呈現先升高后下降的趨勢，15～30 d相對表達量緩慢上升，30～60 d相對表達量激增，并在60 d時相對表達量達到最高。75 d以后表達量突然降低，僅維持較低水平表達(圖 6)。

M. DL 2000；1. 5′-RACE 第一輪；2. 5′-RACE 第二輪；3. Pg4CL 圖1 Pg4CL基因擴增結果M. DL 2000；1. First lane of 5′-RACE；2. Second lane of 5′-RACE；3. Pg4CLFig.1 The amplification of Pg4CL

Lj4CL. 忍冬(AGE10594.1)；Ec4CL. 赤桉(ACX68559.1)；Ph4CL. 矮牽牛 (AEO52694.1)；黑線為2個保守功能域。圖2 Pg4CL及其他物種4CL推定氨基酸序列比對Lj4CL. Lonicera japonica(AGE10594.1)；Ec4CL Eucalyptus camaldulensis(ACX68559.1)；Ph4CL. Petunia hybrida (AEO52694.1)；Two conserved functional domains: SSGTTGLPKGV and GEICIRG were marked by black linesFig.2 Alignment of the predicted amino acid sequences of Pg4CL with other 4CLs

圖3 ‘紅玉石籽’不同組織Pg4CL基因的相對表達量Fig.3 The relative expression of Pg4CL in different tissues of ‘Hongyushizi’

分支點數字表示基于500次重復該節點的自展支持率; 標尺代表遺傳距離Go4CL. 東方山羊豆(ACZ64784.1); Af4CL. 紫穗槐(AAL35216.1); Mi4CL. 杧果 (AIB06734.1); Pf4CL. 泡桐 (ACL31667.1); Pc4CL. 荷蘭芹 (AGZ04576.1). Pg4CL. 石榴 (AFU90743.1)；Ec4CL.赤桉(ACX68559.1)；Gb4CL. 銀杏 (AMN10098.1); Cl4CL. 杉木(AFX98059.1); Vv4CL. 葡萄 (XP_002274994.1)；Ob4CL. 羅勒(AGP02119.1); Gh4CL. 陸地棉 (ADU15550.1); Ft4CL. 苦蕎麥 (AIL93582.1); Zm4CL. 玉米(AAS67644.1)；It4CL. 菘藍 (ADG46006.1); Gm4CL. 大豆(AEX25890.1)圖4 不同物種 4CL 的系統進化分析The nodes in the figure show the bootstrap values based on 500 replications. The scale represents the genetic distance Go4CL. Galega orientalis(ACZ64784.1); Af4CL. Amorpha fruticosa(AAL35216.1)； Mi4CL. Mangifera indica (AIB06734.1); Pf4CL. Paulownia fortunei (ACL31667.1); Pc4CL. Petroselinum crispum (AGZ04576.1); Pg4CL. Punica granatum (AFU90743.1)；Gb4CL. Ginkgo biloba (AMN10098.1); Cl4CL. Cunninghamia lanceolata(AFX98059.1); Vv4CL. Vitis vinifera (XP_002274994.1)；Ob4CL. Ocimum basilicum(AGP02119.1); Gh4CL. Gossypium hirsutum (ADU15550.1); Ft4CL. Fagopyrum tataricum (AIL93582.1); Zm4CL. Zea mays(AAS67644.1); .It4CL. Isatis tinctoria (ADG46006.1); Gm4CL. Glycine max(AEX25890.1)Fig.4 Phylogenetic analysis among different 4CLs

3 討 論

石榴籽粒約占果實重量的4%～10%[25]。石榴籽粒包含假種皮、種皮和種仁3部分，通?？墒秤貌糠譃楹泄募俜N皮。根據種皮的硬度，石榴籽粒分為軟籽、較軟籽、較硬籽、硬籽4類[26]。若與硬籽石榴具有同等口味色澤，軟籽石榴由于其可食率高，則更為消費者所接受。與硬籽實石榴相比，軟籽石榴木質素含量低[27]，因此，調節石榴種皮的木質素含量是培育軟籽石榴的途徑之一。本研究從石榴中克隆了4CL的同源基因，該基因推定的氨基酸序列含有4CL家族基因共有的兩大保守域：SSGTTGLPKGV以及GEICIRG，因此命名為Pg4CL。進化樹分析表明石榴4CL與其他物種中4CLs的起源相同，但在不同時期分離開來。石榴與赤桉親緣關系最近，而與菘藍和大豆親緣關系較遠。

A. 紅玉石籽；B.白玉石籽；C.粉皮；D.會理軟籽；E.蒙自甜；F.突尼斯軟籽圖5 石榴不同品種種皮中Pg4CL基因的相對表達量A. Hongmanaozi; B. Baiyushizi; C. Fenpi; D. Huiliruanzi; E. Mengzitian; F. TunisiruanziFig.5 The relative expression of Pg4CL in seed coat of six pomegranate cultivars

圖6 ‘紅玉石籽’開花后不同時期籽粒中 Pg4CL 基因的相對表達量Fig.6 The relative expression of Pg4CL in different periods of ‘Hongyushizi’ seeds

為分析石榴不同組織中Pg4CL基因的表達特性，以品種‘紅玉石籽’為材料，對葉、果皮、種皮、莖 4個組織中Pg4CL基因的表達水平進行檢測。發現Pg4CL基因在4個組織中均有表達，而在果皮中表達量最高，在種皮中表達量最低，這與在水稻中的研究結果不同[12]，說明Pg4CL基因盡管在多個物種中廣泛存在，但其表達特性并不相同。

選取籽粒硬度不同的6個品種：‘紅玉石籽’、‘白玉石籽’、‘粉皮’、‘會理軟籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯軟籽’，對其籽粒中Pg4CL基因的相對表達量進行檢測。結合之前不同品種籽粒硬度及木質素含量測定的研究[24]，Pg4CL基因在‘會理軟籽’和‘突尼斯軟籽’中的表達量與籽粒硬度及木質素含量趨勢不同，說明Pg4CL基因并不是決定不同品種間石榴籽粒木質素含量的唯一因素，而其表達可能受其他基因及植物體內激素的影響。

對不同時期籽粒中的Pg4CL基因的表達量進行檢測，發現Pg4CL基因的表達量呈現先升高后下降的趨勢。在前60 d，Pg4CL基因的表達量急劇升高，說明這段時期木質素迅速合成并積累。而當木質素含量達到一定范圍時，木質素合成減弱，Pg4CL基因的表達量也隨之下降，僅維持較低水平。進一步說明Pg4CL基因對于石榴木質素的合成具有重要作用。

綜上所述，對石榴Pg4CL基因的時空表達研究發現，Pg4CL基因的表達量與木質素含量存在相關性，是木質素合成的重要調控位點。因此，Pg4CL基因的功能值得深入解析，從而為利用分析生物學手段培育軟籽石榴新品種奠定理論基礎。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Pomegranate 4-coumarate-CoA LigasePg4CL

DONG Lili1，Abdurazak·Isha2, HU Qian1, LI Chuanwei1, ZHANG Shuiming1*

(1 College of Horticulture，Anhui Agricultural University, Hefei 230036，China; 2 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

4-coumaric acid coenzyme A ligase is a key enzyme in lignin biosynthesis pathway. In this study,Pg4CL，the homologous gene of 4CL, was obtained with RACE and RT-PCR method, with ‘Punicagranatumcv. Hongyushizi’ as the test material. The cDNA full-length sequence ofPg4CLwas 2 121 bp, with reduced 544 amino acids. Sequence alignment and functional domain analysis revealed thatPg4CLcontained two conserved domains: SSGTTGLPKGV and GEICIRG. Phylogenetic tree analysis indicated that Pg4CL shared the same origin with other species, and had the closest relationship withEucalyptuscamaldulensisEc4CL. The fluorescent quantitative PCR analysis showed thatPg4CLexpression was detected in leaves, peel, seed coat and stems. The expression in peel and leaves were higher, while in seed coat was the lowest;Pg4CLexpression was detected in six cultivars of pomegranate seeds, and the expression of ‘Tunisiruanzi’ was higher, while ‘Huiliruanzi’ was lower;Pg4CLexpression was detected in different development periods of ‘Fenpi’ seeds. The relative expression ofPg4CLgradually increased from 15 d-60 d, and reached a maximum at 60 d. While sharply declined from 75 d, and maintained a lower level of expression.

pomegranate; 4CL；gene cloning; expression analysis

1000-4025(2016)11-2146-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2146

2016-07-11;修改稿收到日期:2016-11-16

國家自然科學基金(30900971)

董麗麗(1982-)，女，博士，講師，主要從事觀賞植物遺傳育種研究。E-mail: dongli0608@163.com

*通信作者:張水明，博士，副教授， 主要從事園藝植物種質資源與生物技術育種研究。E-mail: zhangshm893@sohu.com

Q785;Q786;S665.4

A