旱麥草EtAP2基因的克隆及其對干旱脅迫的響應表達

王夢瑤，周茜萍，呂新華，馮 麗，孫 黎

(石河子大學 生命科學學院，農業生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832003)

旱麥草EtAP2基因的克隆及其對干旱脅迫的響應表達

王夢瑤，周茜萍，呂新華，馮 麗，孫 黎*

(石河子大學 生命科學學院，農業生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832003)

以旱麥草(Eremopyrumtriticeum)為實驗材料，利用RT-PCR技術從旱麥草葉片中克隆了1個AP2/ERF家族基因，命名為EtAP2(GenBank登錄號KX622583)。EtAP2基因含有1 128 bp開放閱讀框，編碼375個氨基酸，相對分子質量40.87 kD，等電點為5.36。多序列比對和進化樹分析表明，該基因編碼蛋白具有2個AP2保守結構域，與小麥AP2/ERF家族蛋白具有較近的親緣關系。實時熒光定量PCR分析表明，15% PEG 6000模擬干旱脅迫可誘導EtAP2基因在根和葉中表達，且在根中對干旱脅迫的響應大于葉片。研究表明，EtAP2可能參與旱麥草對干旱逆境脅迫應答的調節。

旱麥草；EtAP2；克??；基因表達

AP2/ERF (APETALA2/Ethylene-Responsive Factor，乙烯響應因子)是植物最大的基因家族之一，編碼植物特有的轉錄因子。AP2/ERF超基因家族以AP2/ERF結構域為特征，該結構域由60～70個氨基酸組成，與DNA結合有關。AP2/ERF超基因家族包括AP2、RAV、DREB和ERF亞家族[1]。AP2亞家族又分為AP2和ANT組，ANT組又可細分為ANT、AIL以及PLT組[2]。AP2亞家族成員蛋白通常包含多個AP2/ERF結構域，RAV亞家族轉錄因子包含一個AP2/ERF結構域和B3結構域，DREB和ERF亞家族蛋白僅含有一個AP2/ERF結構域[3]。AP2/ERF基因家族成員在調節植物發育、抵御生物和非生物脅迫中起重要作用[4]。隨著第二代測序技術在植物研究中的應用，AP2/ERF轉錄因子已在多種植物中得到鑒定，如擬南芥[5]、小麥[6]、水稻[7]和玉米[8]等。但目前為止，有關旱麥草(Eremopyrumtriticeum)AP2/ERF家族基因的鑒定和特征研究尚未見報道。

旱麥草是禾本科小麥族旱麥草屬早春短生育期植物，小麥的野生近緣種，主要分布在準噶爾盆地沙區荒漠中，具有生育期短、特早熟、抗旱、耐鹽、分蘗力強、抗白粉病以及光和效率高等優良性狀。本研究以旱麥草為研究對象，根據前期構建的干旱脅迫下的轉錄組數據庫，對旱麥草AP2/ERF轉錄因子家族成員EtAP2基因進行了克隆、序列分析和干旱脅迫下的表達特征研究，以期為后續研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

旱麥草種子由本實驗室成員于2015年6月采自新疆準噶爾盆地荒漠。

1.2 方 法

1.2.1 材料的處理 2016年6月將采集的旱麥草種子種植于石河子大學生命科學學院溫室。將生長2周的旱麥草幼苗用15% PEG 6000[9]分別處理0.5、1、3、6、12、24和48 h，以未處理的旱麥草幼苗為對照，取其根系和葉片樣品液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 旱麥草EtAP2基因的克隆 采用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒(Tiangen，北京)提取旱麥草幼苗葉片總RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase(TaKaRa，大連)將總RNA反轉錄成cDNA。根據課題組通過旱麥草轉錄組測序獲得的 EST 序列(GenBank登錄號為KX622583)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物EtAP2-F和EtAP2-R(表1)，PCR擴增該序列的開放閱讀框(ORF)。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，72 ℃延伸8 min。產物回收純化后與 pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌Trans5α，經菌落PCR驗證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3EtAP2基因的生物信息學分析 序列比對和保守結構預測使用DNAMAN 5.0和Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行。蛋白質基本性質分析使用EXPASY(http://web.expasy.org/protparam/)相關在線工具完成。系統進化樹構建使用MEGA 4.0 軟件進行[10]。蛋白質三級結構使用Swiss-Model (http:/ /swissmode.l expasy.org /) 軟件預測。

1.2.4 旱麥草EtAP2基因表達性分析 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測EtAP2基因在干旱脅迫下的轉錄表達水平?；蛱禺愐餅镋tAP2-RT-F和EtAP2-RT-R，以旱麥草18S rRNA基因為內參，引物為Et18S-F和Et18S-R(表1)。按照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(TAKARA)說明書，在羅氏LightCycler480 PCR儀進行qRT-PCR，分析EtAP2基因相對表達量。擴增程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 min，72 ℃延伸32 s，40個循環。每個樣品做3次重復，以未處理旱麥草為對照。數據采用2-ΔΔCt法計算。

表1 本實驗用到的引物

2 結果與分析

2.1 EtAP2基因克隆及序列分析

根據旱麥草轉錄組測序結果設計引物EtAP2-F和EtAP2-R，通過RT-PCR擴增出一個約1.1 kb片段，與預期大小相同(圖1)。進一步測序分析表明，該片段含有1 128 bp開放閱讀框，編碼375個氨基酸(圖2)，Blast比對結果表明，該ORF編碼的氨基酸序列與小麥TaAP2氨基酸序列相似性最高為96%，因此將該基因命名為EtAP2(GenBank登錄號為KX622583)。

為了解EtAP2轉錄因子的生物活性及潛在功能，利用EXPASY在線分析工具ProtParam對翻譯得到的EtAP2氨基酸組成和理化性質進行分析和預測。結果顯示：EtAP2相對分子質量為40.87 kD，等電點為5.36，酸性氨基酸為16個，堿性氨基酸15個，脂肪族氨基酸含量占89%，而芳香族氨基酸只占6.2%。保守結構域分析發現, 該蛋白在191～262與292～354位氨基酸之間含有2個典型的AP2結構域(圖3)，與其他植物AP2/ERF家族轉錄因子的AP2保守結構域相似度較高，表明EtAP2屬于AP2亞家族。AP2結合域由大約60個氨基酸組成，是非常保守的DNA結合區，在其N-端有一個堿性親水區，具有3個反平行的β-折疊，這3個β-折疊在識別順式作用元件中起到重要的作用[11]。利用protscale工具對EtAP2進行了親水性和疏水性分析，結果表明，EtAP2大部分氨基酸為親水性氨基酸，屬于親水性蛋白。

利用BlastP檢索EtAP2同源蛋白，獲得幾個相似度較高的AP2/ERF氨基酸序列，包括小麥(Triticumaestivum，AK334560)、大麥(Hordeumvulgare，AK252982)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon，XM_014901079.1)、玉米(Zeamays，NM_001138224.1)、谷子(Setariaitalica，XM_004953799.2)和短花藥野生稻(Oryzabrachyantha，XM_015833886)。DNAMAN5.0比對結果(圖3)表明，EtAP2轉錄因子與小麥AP2/ERF相似性最高(96%)，與玉米的相似性較低(83%)。

2.2 EtAP2系統進化分析

為研究旱麥草EtAP2與其他植物同源蛋白之間的進化關系，通過 MEGA 4.0構建了EtAP2與小麥、水稻等物種AP2/ERF家族轉錄因子的系統進化樹(圖4)。結果表明，EtAP2轉錄因子在進化關系上屬于AP2 /ERF家族轉錄因子AP2亞家族中的AIL組，與小麥、山羊草等禾本科植物的AP2蛋白聚為一類，其中與小麥AP2蛋白(AK334560)的親緣關系最近，屬于同一進化分支。

2.3 EtAP2轉錄因子的三級結構預測與分析

利用Swiss model程序對EtAP2進行蛋白質三級結構同源建模分析(圖5)，結果表明該蛋白與擬南芥AP2/ERF家族AtERF1蛋白的三級結構相似性為 44.26%。該結構中存在一個由色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸組成的保守序列。2個AP2結構域位于DNA的大溝中，都存在一個接頭區，大概由30個氨基酸組成[12]。在與目的基因結合過程中，前一個AP2結構域與5′-C端結合，后一個與3′-N端結合[13]。

2.4 EtAP2基因在模擬干旱脅迫下的表達分析

為了研究EtAP2基因對干旱脅迫的響應，利用qRT-PCR方法檢測了其在旱麥草根和葉片中的表達量(圖6)。在15% PEG6000模擬干旱脅迫處理下，EtAP2在葉中的表達變化相對平緩，在0.5 h有輕微下降，1 h時輕微上升，3 h表達量最低，之后在6 h達到最高水平，為對照的1.7倍，在12～48 h呈現降-升-降的趨勢。在干旱脅迫處理48 h之內，EtAP2在根中的表達量都高于對照，3 h達到最大，是對照的21倍，之后在6 h又急劇下降，直到48 h表達水平最低。這些結果表明，在干旱處理條件下，EtAP2的表達水平被顯著誘導，且在根系中對干旱的響應大于葉片。

M. DL2000; 1. PCR擴增產物圖1 EtAP2基因的RT-PCR擴增M. DL2000; 1. Product of PCRFig.1 RT-PCR application of EtAP2

圖2 EtAP2蛋白結構域分析Fig.2 Protein domain analysis of EtAP2

AK334560. 小麥；AK252982. 大麥；XM_014901079.1. 二穗短柄草；XM_015833886. 短花藥野生稻；XM_004953799.2. 谷子；NM_001138224.1. 玉米圖3 旱麥草EtAP2蛋白序列的多重比對AK334560. Triticum aestivum；AK252982. Hordeum vulgare；XM_014901079.1. Brachypodium distachyon；XM_015833886. Oryza brachyantha；XM_004953799.2. Setaria italica；NM_001138224.1. Zea maysFig.3 Multi-alignment of EtAP2 protein with AP2 proteins in plants

圖中各節處數字表示重復1 000次Bootstrap值，括號內為氨基酸登陸號圖4 旱麥草EtAP2與其他AP2蛋白的系統進化樹The numbers at note represent the bootstrap values with 1 000 replicates in this figure, and the accession number of each sequence is given in the bracketFig.4 Phylogenetic analysis of EtAP2 and other plant AP2 proteins

箭頭所指方向為DNA分子圖5 AtERF1和 EtAP2轉錄因子DNA結合域三維結構建模The arrow head is DNAFig.5 Three-dimensional structure modeling of DNA-binding domain of EtAP2 and AtERF1 protein

圖6 EtAP2基因在模擬干旱脅迫下在旱麥草幼苗根和葉中的表達Fig.6 Expression of EtAP2 in roots and leaves of E. triticeum seedlings under simulated drought stress

3 討 論

植物在干旱等逆境脅迫下會在生理和基因水平上進行自身調整，以適應外界環境。AP2/ERF作為重要的轉錄因子，在植物自身調節中起到非常關鍵的作用，能夠快速調節植物體內相關基因的表達來提高植物對逆境脅迫的耐受性[14]。旱麥草分布在干旱、瘠薄荒漠地區，生長發育過程會受到各種非生物因素的影響，研究其抗逆相關基因并進行功能分析，有助于從分子機制上進一步了解其適應逆境的機理，同時為小麥等農作物的抗逆性狀改良提供候選基因。

AP2/ERF家族是植物普遍存在的一類轉錄因子，廣泛參與植物逆境脅迫誘導[15]。許多研究表明，過量表達某些AP2/ERF轉錄因子基因會增強植物的抗旱性。Dossa等[16]對芝麻進行轉錄組分析后，發現一個AP2si16基因，可以作為增強芝麻耐旱性的候選基因之一。Zhang等[17]從大豆中克隆一個GmERF3基因，并將其在煙草中過表達，在干旱條件下，轉基因煙草中游離脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量明顯高于非轉基因煙草，顯著增加了煙草對干旱和高鹽的耐受性。Zeng等[18]對AP2/ERF家族蛋白進行了系統分析，發現該家族蛋白主要參與植物的生長發育和對各種脅迫的應激反應，包括光形態建成，花的發育，干旱和寒冷的應激反應以及對生長素和脫落酸的敏感性等。

本研究以旱麥草為研究對象，從干旱脅迫的幼苗中克隆了EtAP2基因的cDNA，該基因編碼的氨基酸序列具有AP2/ERF轉錄因子家族的基本特征，都含有AP2結合域。系統進化樹分析結果表明，EtAP2轉錄因子與小麥親緣關系最近，都屬于AP2亞族。本研究中qRT-PCR分析表明，EtAP2的表達量受干旱誘導，并且在根中的表達對干旱脅迫的響應程度大于葉片，說明EtAP2基因在干旱脅迫條件下可能參與基因表達調控，可以作為小麥等農作物抗性育種重要的候選基因。這些研究將有助于了解AP2/ERF轉錄因子EtAP2在旱麥草逆境調控中的作用，為進一步研究和解析AP2/ERF家族其他成員的功能提供參考。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Response to Simulated Drought Stress ofEtAP2 fromEremopyrumtriticeum

WANG Mengyao, ZHOU Xiping, Lü Xinhua, FENG Li, SUN Li*

(Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003, China)

A AP2/ERF gene was isolated fromEremopyrumtriticeumby RT-PCR method, and designated asEtAP2 (GenBank accession no. KX622583).EtAP2 contained an open reading frame (ORF) of 1 128 bp encoding 375 amino acids. The molecular mass of EtAP2 was 40.87 kDa with isoelectric point (PI) of 5.36. Multiple sequences alignment and phylogenetic analysis indicated that EtAP2 protein contained two conserved AP2 domains, which had close genetic relationship with AP2/ERF transcription factor inTriticumaestivum. Quantitative real-time PCR analysis revealed that simulated drought stress (15% PEG6000) treatment significantly induced the expression ofEtAP2, and root is more sensitive to drought stress than leaf. The results indicated thanEtAP2 might involve in response to drought stress regulation inE.triticeum.

Eremopyrumtriticeum;EtAP2; cloning; gene expression

1000-4025(2016)11-2167-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2167

2016-09-16;修改稿收到日期:2016-11-01

石河子大學高層次人才科研啟動資金(RCZX201139)

王夢瑤(1993-)，男，在讀碩士生，主要從事植物分子生物學研究。E-mail:1561855244@qq.com

*通信作者:孫 黎，博士，副教授，主要從事植物分子生物學研究。E-mail: sunlishz@126.com

Q785;Q786

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