九味補血口服液質量標準研究

黃若干　裴澤建　黃平權　藍曉東　覃佩莉　梁杰敏　林海英　王小紅

【摘 要】 目的：提高九味補血口服液質量標準。方法：采用薄層色譜法對人參、絞股藍、黃芪進行定性鑒別，采用HPLC法對五味子中五味子醇甲進行定量分析。結果：人參與絞股藍、黃芪的薄層色譜均具有特征性的清晰斑點，陰性溶液無干擾；五味子醇甲在005100～15300μg范圍內其峰面積與進樣量呈良好的線性關系，平均加樣回收率為10097%（RSD=091%）。結論：研究建立的定性鑒別與定量分析方法靈敏、準確，具有良好專屬性和重現性，更能有效控制九味補血口服液的質量。

【關鍵詞】 九味補血口服液；人參；絞股藍；黃芪；五味子醇甲

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）23-0016-04

九味補血口服液由人參、黃芪、絞股藍、當歸等藥味組成，具有益氣補血、健脾益胃的功效。原標準只建立當歸、甘草、陳皮的薄層色譜鑒別和正丁醇提取物測定方法，方中君藥人參、黃芪等均未建立有定性或定量的質控指標，為能更加有效控制本品質量，實驗開展人參、黃芪、絞股藍薄層色譜鑒別研究和五味子中五味子醇甲HPLC測定研究。

1 儀器與材料

11 儀器 LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津）。

12 材料 人參皂苷Rb1（批號：110704-200318）、人參皂苷Rg1（批號：110713-200322）、黃芪甲苷（批號：0781-200109）、五味子醇甲（批號：110857-201513）對照品、人參（批號：120917-200406）、絞股藍（批號：121311-200402）對照藥材均購自中國藥品生物制品檢定研究院；九味補血口服液（批號：131201、131202、131203，廣西盈康藥業有限責任公司）。乙腈、磷酸為色譜醇；水為純化水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

21 薄層色譜鑒別

211 人參和絞股藍的薄層鑒別 取本品30mL，加三氯甲烷30mL，振搖提取，分取上層溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次（30mL，30mL，20mL），合并正丁醇提取液，用氨試液提取2次，每次50mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50mL，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加10%乙醇5mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑15cm，長12cm），用水50mL洗脫，棄去水洗脫液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參對照藥材08g和絞股藍對照藥材2g，同法制備成對照藥材溶液；再取人參皂苷Rb1、Rg1對照品加甲醇制成每1mL各含1mg的對照品溶液。按處方比例制備缺人參、絞股藍的陰性樣品，同法制成陰性溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版四部通則0502）試驗，吸取上述溶液各1～2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑[1]8，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，分別與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖1。

212 黃芪的薄層鑒別 取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。取211項的供試品溶液作為供試品溶液。按本品制法制備缺黃芪陰性樣品，同法制備陰性溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版四部通則0502）試驗，吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各1～2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上層溶液）-甲醇（10∶1）[1]302為展開劑，置氨氣飽和的層析缸內，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性試驗無干擾。見圖2。

22 五味子醇甲的含量測定[1]66

221 色譜條件及系統適用性 照中國藥典2015版四部通則0512高效液相色譜法，色譜柱為日本島津公司BDS C18柱（46mm×250mm，5μm）；以甲醇-水（60∶[KG-*3/5]40）為流動相；檢測波長為250nm；理論板數按五味子醇甲峰計算應不低于1500。

222 溶液的配制 ①對照品溶液制備：精密稱取五味子醇甲對照品適量，加甲醇制成每1mL含50μg的對照品溶液。②供試品溶液制備：精密量取本品10mL，置分液漏斗中，加水20mL，混勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘渣分次加甲醇適量使溶解并轉移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。③陰性樣品溶液制備：按標準處方工藝制備不含五味子的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備成陰性樣品溶液。

分別精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，專屬性試驗色譜圖見圖3、4、5。試驗結果表明，供試品色譜圖中，在與對照品色譜圖相應的位置有相應的色譜峰出現，且該色譜峰和其他組分色譜峰分離度符合規定，陰性樣無干擾，說明該方法的系統適用性和專屬性良好。

223 線性關系試驗 精密稱取五味子醇甲對照品1275mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（含五味子醇甲02550mg/mL），精密量取該貯備液05mL、25mL、50mL、75mL、10mL、125mL、15mL分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對照液各10μL注入液相色譜儀，結果峰面積分別為97065、497390、993624、1500990、2016087、2520814、3022343。以五味子醇甲峰面積（A）為橫坐標，對照品進樣量（μg）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y=50460×10-7X -00047（r=09999，n=7）。結果五味子醇甲在005100～15300μg范圍之間線性關系良好。

224 精密度試驗 精密吸取同一批樣品的供試品溶液10μL注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄五味子醇甲色譜圖及峰面積，分別為1075998、1067577、1065693、1067843、1079951、1082658，平均峰面積1073287，RSD為067%（n=6），表明精密度良好，符合要求。

225 重復性試驗 取本品同一批號的樣品，照含量測定項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算含量分別為5406、5379、5413、5384、5376、5425μg/mL，平均5397μg/mL，RSD為038%（n=6），說明重復性良好。

226 穩定性試驗 照上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，取該供試品溶液分別于0h、4h、8h、16h、24h測定峰面積，分別為1076001、1069854、1072581、1070732、1078765、1069781，平均1072952，RSD為034%。表明供試品溶液24h內穩定性良好。

226 加樣回收試驗 取已知五味子醇甲含量的本品同一樣品（批號：131201，含量為5397μg/mL），精密量取5mL，加水25mL，共9份，分別精密加入對照品貯備液（濃度為01376mg/mL）1mL、2mL、3mL，低、中、高濃度各3份，照供試品溶液制備項下的方法處理、測定。結果表明，本法加樣回收率相對標準偏差符合標準規定。結果見表1。

227 樣品的含量測定 按上述含量測定方法測定了本品10批樣品五味子醇甲的含量，結果分別為540、617、456、731、542、428、419、563、647、692μg/mL。

3 討論

31 人參中含有多種人參皂苷，絞股藍中主要含四環三萜皂苷，其中多種皂苷結構與人參皂苷相同，如人參皂苷Rb1、Rd、Rb3和F2等[2]，為方便實驗操作，故在預試驗時就設計采用同一方法同時對這兩味藥材進行薄層鑒別。在進行人參、絞股藍薄層鑒別預試驗摸索過程中，曾嘗試使用過（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]5）上層溶液）-甲醇（10∶[KG-*3/5]1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶[KG-*3/5]40∶[KG-*3/5]22∶[KG-*3/5]10）等展開劑，但因制劑中含皂苷成分太多，分離效果均不夠理想，最終以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑最為理想，在此條件下，斑點能較好的分離且清晰圓整，Rf值適宜，方法簡便，重現性好。

32 《中國藥典》中黃芪使用黃芪甲苷作為對照品進行薄層鑒別，我們也擬定采用黃芪甲苷作為本藥材的鑒定指標。在進行黃芪薄層鑒別預試驗時，曾嘗試使用三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層液等展開劑，分離效果均不夠理想，最終以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上層溶液）-甲醇（10∶1）為展開劑最為理想，此法重現性好，專屬性強。

33 在進行本試驗的含量測定方法摸索時，曾嘗試使用HPLC法對方中的人參、絞股藍建立含量測定方法，以人參皂苷Rb1、Rg1對照品為含測指標，但陰性樣有干擾而無法建立。五味子醇甲含測方法流動相經選擇甲醇-水不同比例進行比較，最終甲醇-水的比例為60∶40時主成分峰分離度、峰形最佳；五味子醇甲甲醇溶液在250nm處有最大吸收而選擇此波長作為檢測波長；對于供試品溶液的制備，曾選用乙醚、乙酸乙酯對樣品進行萃取處理，結果乙醚萃取乳化嚴重，而乙酸乙酯萃取效果良好而被選用。

本試驗對方中的人參、絞股藍、黃芪等藥味進行定性鑒別和對五味子醇甲進行定量測定，方法靈敏、準確，具有較好專屬性和重現性，為九味補血口服液提升質量控制方法提供具有參考價值的科學依據。從測定的10批樣品中五味子醇甲的含量來看，五味子醇甲的最低含量為419μg/mL，最高為731μg/mL。造成樣品中五味子醇甲含量高低不均的原因，應該是五味子藥材不同批次之間因產地、采收季節、貯藏等因素的影響而使五味子醇甲含量存在差異性，因此在投料生產時要把好藥材質量關，以保證制劑質量的穩定性。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：8，302，66.

[2]國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1999：533.

（編輯：程鵬飛）