基于液體透鏡的激光誘導熒光檢測裝置設計

胡馨然，牛禮軍，胡曉明，周 雅

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基于液體透鏡的激光誘導熒光檢測裝置設計

胡馨然1a，牛禮軍2，胡曉明1b，周 雅1a

( 1. 北京理工大學a. 光電學院；b. 生命學院，北京 100081；2. 中國電子科技集團公司第四十一研究所，安徽蚌埠 233000 )

針對共聚焦型激光誘導熒光檢測技術對微米尺度微流控芯片溝道檢測存在對焦困難，檢測精度受離焦影響嚴重的問題，本文提出了一種利用液體透鏡連續變焦實現微溝道自動對焦的激光誘導熒光檢測裝置，并針對系統設計了基于圖像清晰度評價的自動調焦算法。裝置根據采集的微流控芯片溝道圖像自動調整聚焦點位置，保證最優的激發光與誘導熒光收集。實驗結果表明：本文設計的激光誘導熒光檢測裝置可實現對微流控芯片溝道的快速自動對焦，波動范圍在0.5%之內，變異系數為1.5‰。它為提高微流控芯片的檢測精度和設計靈活性提供了可能。

微流控芯片；激光誘導熒光檢測；液體透鏡；自動調焦

0 引 言

自二十世紀九十年代初來自瑞士的Manz等人提出了微全分析系統(Micro Total Analysis System, μTAS)的概念后[1]，微流控芯片技術不斷發展，對分析儀器走向微型化、集成化、自動化的方向做出了重要貢獻[2]。它是一種以在微米尺度的空間中對流體進行操控為主要特征，將生物和化學實驗室的基本功能微縮到一個幾平方厘米大小的芯片上。由于微流控芯片尺度小，溝道寬度和深度尺度都在微米量級，檢測精度對實驗結果分析至關重要。微流控芯片的檢測根據檢測方式分為多種，而激光誘導熒光檢測技術(Laser Induced Fluorescence Detection，LIFD)是用于微流控芯片檢測的靈敏度最高的檢測技術之一。

激光誘導熒光檢測是至今為止針對微流控芯片檢測使用最早，應用最廣泛的光學檢測[3]，它的檢測靈敏度可達10-9～10-13mol/L。與非共聚焦型LIFD相比，共聚焦型LIF檢測器對熒光與激發光、反射光、雜散光的分離更為完全，可以有效改善檢測靈敏度和信噪比，具有較高的檢測靈敏度，但系統共焦檢測也給檢測條件和手段要求提高了。目前的檢測方法通常是通過人工手動調節對焦，檢測重復性受人為因素影響較大。針對這個問題，劉翻[4]等人設計的三維可調共聚焦激光誘導熒光檢測器中對激光光斑位置的調整采用了一種三維反射鏡調節裝置；劉云亮等人[5]設計的基于共聚焦原理的激光誘導熒光檢測器中對激光光斑對焦位置的調整采用了一個三維移動平臺；李偉[6]等人設計的共聚焦式激光誘導熒光檢測裝置中利用三個電控位移臺來實現移動對焦。上述設計都是依靠移動整體光學成像系統，改變光學系統的成像物平面實現焦點位置調焦。雖然調整過程可以使用自動來代替手動，一定程度上擴展了使用靈活性，但是靠機械移動部件完成成像物面調整來實現自動調焦，控制靈活度和測量精度仍然有限。同時機械結構移動的不穩定會帶來一定的誤差和噪聲，影響調焦結果。為了解決這個問題，我們提出了一種采用液體透鏡結合自動調焦算法實現微溝道自動對焦的檢測，使LIFD裝置可以根據采集的微流控芯片溝道圖像實現自動對焦，保證檢測結果質量的同時也可以保證激光的激發效率。

1 液體透鏡自動對焦LIFD系統設計

1.1 自動對焦LIFD總體系統設計

經典的共聚焦LIFD結構如圖1(a)所示，激光發射光束由二色鏡反射后，經顯微物鏡的聚焦把激光束聚焦在檢測溝道內，誘發的熒光經顯微物鏡收集穿過二色鏡和濾光片后，由光電倍增管探測其強度，另一方面在二色鏡后方加入CCD攝像機監視溝道情況，有利于聚焦、觀察和圖像采集操作。激發光束的匯聚點和產生的熒光匯聚點在同一條直線上，因此稱為共聚焦型LIF檢測器。

圖1 共聚焦激光誘導熒光檢測系統

圖2 基于液體透鏡激光誘導熒光檢測裝置結構圖

共焦檢測的結構可以濾除大部分的雜散光，提高檢測精度，但也給檢測條件和手段提高了要求。當使用LIFD對微控流芯片進行檢測時，LIFD是否準確對焦對檢測結果有很大影響。由共聚焦LIFD原理示意圖可以看出，激光光源的聚焦位置為實際的檢測窗口，該聚焦位置與微流控芯片的檢測溝道的三維空間重合程度極大的影響了裝置的檢測能力與檢測重復性。由于加工精度的限制造成檢測液流的空間位置與激光誘導熒光裝置的預設位置有偏差，這就是共聚焦型LIFD的主要檢測誤差來源。如圖1(b)所示，只有理想焦平面上的物體光束才能通過光闌，為光電倍增管收集。而對于偏離理想焦平面的位置，大部分光線會被光闌阻擋，無法進入系統。微流控芯片結構特征尺寸一般在十幾到幾十個微米，當沒有正對焦面時，一方面，會造成本來就相對較弱的檢測熒光收集能量大幅減弱，導致信噪比降低；另一方面，共焦結構的激發激光也因離焦造成激發能量降低，對共焦型檢測結果質量影響很大。

液體透鏡是一種基于仿生學的光學器件，它利用某種控制方法改變透鏡的折射率或形狀來調整焦距，實現焦距的連續變化。將液體透鏡引入變焦距光學系統而不需要引入任何機械運動部件將會給變焦光學系統的發展帶來革命性的變化[7-8]。在本文中，我們在激光誘導熒光檢測裝置中使用液體透鏡，結合LIFD中的顯微物鏡實現變焦光學系統。

由圖1(a)分析可以知道，光電倍增管收集的熒光和樣品是共軛關系，CCD上溝道圖像和樣品是共軛關系?？梢酝ㄟ^使用CCD采集圖像對溝道聚焦情況進行判定[6]。圖2是本文中設計的基于液體透鏡的激光誘導熒光檢測裝置。裝置由共聚焦光學系統、液體透鏡和計算機組成。微流控芯片通過共聚焦光學系統成像，CCD攝像機將采集的芯片溝道圖像傳輸給主控計算機，計算機根據計算結果控制液體透鏡焦距改變實現軸向自動對焦。

1.2 LIFD系統自動對焦評價算子設計

在激光誘導熒光檢測中，溝道清晰成像是聚焦判斷依據。圖像清晰度反饋自動調焦是通過清晰度評價函數對采集圖像清晰度評價，反饋相應電學參數，進而控制光學系統調整系統參數，直至最終得到最清晰的像。圖像清晰度評價的自動調焦靈活性好，不需要引入機械運動部件，因此本文采用圖像清晰度評價控制完成自動調焦。

清晰度評價函數性能會直接影響對焦效果。理想的調焦評價函數應該具有良好的無偏性，單峰性和較高靈敏度。此外，在顯微鏡觀測的情況下，應該還需要較好的實時性和穩定性。目前常見的數字圖像評價函數主要有灰度變化函數、梯度函數、圖像灰度熵函數和頻域類函數[9]。經常用于自動調焦中的評價函數有Tenengrad函數、Brenner函數、Roberts梯度函數、Sobel梯度函數、Laplacian函數、Variance 函數等[10]。對于微流控芯片溝道圖像，溝道邊緣銳利程度不大，灰度分布不均勻，Laplacian等對邊緣敏感的評價函數可能會出現偏差，同時，由于微流控芯片溝道圖像中目標體積不大，背景體積大，因此需要考慮盡量大的模板來減小背景的影響?；谝陨咸攸c，選取基于SUSAN算子的評價函數[11]來完成自動對焦算法。SUSAN算法能有效的對圖像進行角點提取和邊緣檢測[12]。它使用一種近似圓形的模板。用模板在圖像上移動，模板內每個圖像像素點的灰度值()都與模板中心像素的灰度值(0)作比較，若模板內某個像素的灰度與模板中心像素(核)灰度差小于設定閾值，則認為該點與核具有相同或相近的灰度，可由下式描述：

所有滿足這一條件的像素組成的區域稱為核值相似區(Univalue Segment Assimilating Nucleus, USAN)，計算式如下式：

當圓模板越接近邊緣和角點時USAN的值越小，反之越大。當USAN小于設定閾值時，即認定此點為邊緣點。

在自動對焦的過程中，圖像越清晰，包含的邊緣信息越豐富，含有大于零的(0)分量越多；反之，圖像越模糊，圖像所含有的大于零的(0)分量越少。因此，將對焦窗口內各點(0)值的絕對值的和作為圖像的清晰度評價函數，則在圖像對焦窗口的Rect區域內，計算式為

我們對液體透鏡輸出連續同向驅動電流使液體透鏡焦距連續變化，采集微流控芯片溝道從離焦到對焦再到離焦狀態的41幅圖像。如圖3是41幅圖片中6個不同焦深的示例。用SUSAN函數對41幅圖像進行處理，得到結果如圖4。圖中橫坐標是圖片的編號，縱坐標是評價函數的清晰度評價值。實驗結果中可以看出，基于SUSAN算子的清晰度評價函數曲線單峰性好，誤差較??；評價曲線較光滑，具有良好的單峰性，無偏性以及尖銳性，適合LIFD的自動調焦算法。

圖3 不同離焦狀態下的6幅圖片

圖4 SUSAN算子處理圖像結果

2 基于液體透鏡的LIFD自動調焦實現

2.1 LIFD自動調焦實驗系統設計

為了驗證本文提出的基于液體透鏡自動對焦的LIFD系統，設計了調焦系統的驗證實驗。實驗檢測的微流控芯片是一個長75 mm，寬26 mm，溝道寬度和深度都是50 μm的電泳芯片，如圖5所示。實驗裝置如圖6，微流控芯片置于基座上，使用白光LED陣列輔助光源照明。采用寧波遠明激光技術有限公司的半導體泵浦激光器LSR473HOEM-50作為激發光源，Optotune公司液體透鏡EL-10-30-Ci[13]結合40倍顯微物鏡構成共焦光學系統物鏡組對微流控芯片成像；使用MINTRON公司的型號為MTV-1881EX-3的CCD作為圖像傳感器；共焦系統成像清晰度評價和自動變焦控制由計算機完成。

圖5 微流控芯片

圖6 基于液體透鏡的激光誘導熒光檢測裝置圖

調焦實驗中，我們使用評價函數反饋控制輸出電流對液體透鏡的焦距進行控制，實現連續變焦。液體透鏡EL-10-30-Ci的控制源是一個恒流源，其電流大小為0 mA到300 mA，常溫下電壓不超過5 V。EL-10-30-Ci中有兩個腔體，腔體內分別填充入兩種折射率不同的液體，兩個腔體間由一個彈性聚合物薄膜分隔，圖7給出了液體透鏡的變焦過程。圖7(a)中，給液體透鏡加上低電流時，透鏡的焦距較大；圖7(b)中，給液體透鏡加上高電流時，透鏡焦距較小。圖7(a)中箭頭的位置是變焦時控制部分施加壓力的位置，這個壓力使溝槽內的液體被擠壓到靠近中心的位置，中心位置明顯凸起，即曲率半徑發生變化，最終使液體透鏡的焦距發生改變。

在調焦過程中，我們使用登山式控制算法進行反饋調節控制液體透鏡電流。登山式控制算法[14]的原理圖如圖8。變焦過程從點開始，首先向某一方向改變一個步進值，對兩次所在位置的結果進行比較，通過評價值大小關系判斷出峰值所在的方向。然后開始以最大的步進值向峰值方向運行。直到產生1<2的情況就能夠判斷算法已經過了峰值焦距點，于是從1開始以一個較小的步進值反方向進行運算。不斷重復這個過程，即找到降低點，換用更小的步進值反方向計算，最終直到步進值已達到最小并且產生降低現象時，此處的值即可以認定為本次計算的峰值。實驗中，首先采集一幅圖像，對圖像進行評價，再往某個方向改變調節參數的一個步進值，再采集圖像并進行評價，比較兩個評價值大小，判斷出峰值所在方向，并調整步進值，直至找到評價峰值即對焦準確的位置，完成自動對焦。

圖7 液體透鏡的調焦原理圖

圖8 登山式控制算法原理圖

2.2 基于液體透鏡的LIFD自動調焦實驗

使用LIFD對微流控芯片進行檢測時，會出現兩種可能的離焦情況：實際距離大于工作距離和實際距離小于工作距離。為了驗證本文設計的液體透鏡自動調焦算法在這兩種情況下的性能，我們設計了兩組實驗來驗證。當實際距離大于和小于工作距離時初始位置和調焦后圖片如圖9和圖10所示。

圖9 大于工作距離自動調焦過程

圖10 小于工作距離自動調焦過程

2.3 LIFD自動調焦穩定性評價

2.2的實驗結果可以證明，本文設計的基于液體透鏡自動對焦的激光誘導熒光檢測裝置在針對微流控芯片檢測中，能夠根據采集到的微流控芯片溝道圖像實現自動對焦。

在實際的檢測應用中，調焦結果的重復性也是系統的重要評價指標。因此，本文還設計一組重復性實驗來檢驗系統穩定性。使用系統對同一距離目標進行了10次自動調焦實驗，控制電流變化在80 mA到130 mA之間。表1是10次自動調焦實驗初始圖像評價值和最后穩定圖像評價值。

將10次調焦實驗最后穩定的圖像評價值記錄并歸一化得到圖11。從圖11中，可以看出，10次自動調焦圖像完成的評價值較穩定，近似為一條直線。直線波動范圍內0.5%之內。變異系數(方差除以均值)為1.5‰?？梢钥闯龌谝后w透鏡自動對焦的算法穩定好。

表1 10次自動調焦實驗初始評價值和最終評價值

圖11 自動調焦算法穩定性實驗

3 結 論

與現有的傳統的依靠機械移動的變焦距光學系統相比，本文提出的基于液體透鏡自動對焦的激光誘導熒光檢測裝置，具有良好的單峰性，無偏性和穩定性的SUSAN算子清晰度評價函數設計自動對焦算法。實驗證明本文設計的激光誘導熒光檢測裝置可實現對微流控芯片溝道的快速自動調焦，并且10次完成調焦時的圖像評價值穩定，波動范圍在0.5%之內，穩定性好，為提高微流控芯片的檢測精度和設計靈活性提供了可能。

[1] Manz A，Graber N，Widmer H M，. Miniaturized total chemical analysis systems：A novel concept for chemical sensing [J]. Sensors and Actuators B-chemical(S0925-4005)，1990，1(1)：244-248.

[2] 方肇倫，方群. 微流控芯片發展與展望 [J]. 現代科學儀器，2001，4(3/6)：1-2.

FANG Zhaolun，FANG Qun. Developments and Trends of Microfluidic Chip Analytical Systems [J]. Modernentific Instruments，2001，4(3/6)：1-2.

[3] 戴旭東. 微流控芯片中壓力效應對分離重現性影響研究 [D]. 大連：大連理工大學，2009：5-6.

DAI Xudong. The Study of the pressure effect on separation repeatability in microfluidic chip [D]. Dalian：Dalian University of Technology，2009：5-6.

[4] 劉翻，于淑新，唐濤，等. 新型三維可調共聚焦激光誘導熒光檢測器的研制與評價 [J]. 色譜，2011，29(9)：896-900.

LIU Fan，YU Shuxin，TANG Tao，. Development and evaluation of a novel three-dimensional adjustment confocal laser-induced fluorescence detector [J]. Chinese Journal of Chromatography，2011，29(9)：896-900.

[5] 劉云亮. 基于共聚焦原理的激光誘導熒光檢測器 [D]. 大連：大連理工大學，2012：19-23.

LIU Yunliang. Laser induced fluorescence detector based on the confocal principle[D]. Dalian：Dalian University of Technology，2012：19-23.

[6] 李偉. 共聚焦式激光誘導熒光檢測裝置的研究 [D].大連：大連理工大學，2006：9-16.

LI Wei. The study of confocal laser induced fluorescence detection device[D]. Dalian：Dalian University of Technology，2006：9-16.

[7] 張鷹，張新，史廣維，等. 液體透鏡在變焦系統中的應用 [J]. 中國光學，2013，6(1)：46-56.

ZHANG Ying，ZHANG Xin，SHI Guangwei，. Application of liquid lens in zoom systems [J]. Chinese Optics，2013，6(1)：46-56.

[8] 高贊. 自動聚焦評價函數的精確度和穩定性研究 [D].濟南：山東大學，2007：32-34.

GAO Zan. The study of accuracy of the automatic focusing evaluation function and stability [D]. Jinan：Shandong University，2007：32-34.

[9] 曹茂永，孫農亮，郁道銀. 基于灰度梯度的數字圖像評價函數 [J]. 光電工程，2003，30(4)：69-72.

CAO Maoyong，SUN Nongliang，YU Daoyin. Digital image evaluation function based on gray gradient [J]Opto-Electronic Engineering，2003，30(4)：69-72.

[10] 趙輝，鮑歌堂，陶衛. 圖像測量中自動調焦函數的實驗研究與分析 [J]. 光學精密工程，2004，12(5)：531-536.

ZHAO Hui，BAO Getang，TAO Wei. Experimental research and analysis of automatic focusing function for imaging measurement [J]. Optics and Precision Engineering，2004，12(5)：531-536.

[11] 張艷超，趙建，韓希珍，等. SUSAN 清晰度評價函數在自動對焦中的應用 [J]. 中國光學，2014，7(2)：240-244.

ZHANG Yanchao，ZHAO Jian，HAN Xizhen，. Application of SUSAN definition evaluation function in auto-focusing [J]. Chinese Optics，2014，7(2)：240-244.

[12] 李惠光，王帥，沙曉鵬，等. 顯微視覺系統中自動聚焦技術的研究 [J]. 光電工程，2014，41(8)：1-9.

LI Huiguang，WANG Shuai，SHA Xiaopeng，. Study of Auto Focusing Technique of Micro-vision System [J]. Opto-Electronic Engineering，2014，41(8)：1-9.

[13] Blum M G，Bueler M，Gratzel C，. Compact optical design solutions using focus tunable lenses [J]. Proceedings of SPIE(S0277-786X)，2011，8167(1)：2.

[14] 任四剛，李見為，謝利利. 基于灰度差分法的自動調焦技術 [J]. 光電工程，2003，30(2)：53-55.

REN Sigang，LI Jianwei，XIE Lili. Automatic focusing technique based on gray scale difference method [J]. Opto-Electronic Engineering，2003，30(2)：53-55.

A Novel Laser Induced Fluorescence Detection Device Based on Liquid Lens

HU Xinran1a，NIU Lijun2，HU Xiaoming1b，ZHOU Ya1a

( 1. a. School of Optoelectronics;b. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China；2. The 41st Institute of China Electronics Technology Group Corporation, Bengbu233000, AnhuiChina)

Laser Induced Fluorescence Detection (LIFD) technology is one of the most sensitive means for the microfluidic chip detection in which application field it is important to achieve accurate focus due to the small size of microfluidic chip. A novel LIFD based on liquid lens is proposed to obtain the optimal excitation light and the induced fluorescence collection, which is capable of adjusting focus position in three-dimension automatically according to the information provided by the images. The autofocus algorithm for LIFD is accomplished with the combination of SUSAN operator and the mountain climbing control algorithm. A tunable liquid lens based on LIFD experimental prototype is set up to testify the proposed system and algorithms. Experimental results show that the system can achieve the autofocus of microfluidic chip. The repeatability experimental results indicate that the evaluation of the last picture in each single experiment has a steady feature with a fluctuation of 0.5% and coefficient of variation of 1.5‰. It provides a solution to improving the detection accuracy and a design flexibility of microfluidic chip.

microfluidic chip; laser induced fluorescence detection; liquid lens; auto-focus

1003-501X(2016)12-0058-07

TH74

A

10.3969/j.issn.1003-501X.2016.12.010

2016-03-14；

2016-06-02

北京高等學校青年英才計劃(YETP1170)

胡馨然(1993-)，女(漢族)，湖南株洲人。碩士研究生，主要研究工作是光電儀器研究。E-mail：huxinranbit@163.com。