結核菌快速檢測技術進展

劉偉 葉永鋒 天津市濱海新區塘沽傳染病醫院 （天津 300454）

結核菌快速檢測技術進展

劉偉 葉永鋒 天津市濱海新區塘沽傳染病醫院 （天津 300454）

結核菌都是利用傳統涂片鏡檢方法來予以檢測，存在著較大的問題：培養時間需要60～90d，且檢出率不到35%，給結核菌的診斷與治療帶來了較大的困難，因此，醫學界亟待出現結核菌快速檢測技術，本文分別從液體培養技術、固體培養技術、硝酸鹽還原酶測定（NRA）技術等方面深入探討了結核菌快速檢測技術進展，具有一定的參考價值。

結核菌 快速檢測 技術

1.前言

從目前來看，結核病的發病率在最近幾年內呈現出較為明顯的上升趨勢。據世界衛生組織的統計數據來看，全球有超過20億人不同程度感染了結核，并且每年還會出現890萬新發結核菌病例，還有160萬結核菌患者死亡[1]。我國也是結核病高發國，發病人數居于全球第二，僅次于印度，每年會出現145萬新發結核菌病例，還有20萬結核菌患者死亡[2]。通常而言，結核菌都是利用傳統涂片鏡檢方法來予以檢測，存在著較大的問題：培養時間需要60～90d，且檢出率不到35%[3]，給結核菌的診斷與治療帶來了較大的困難。國外內醫學界已經越來越重視結核菌快速檢測技術，希望能夠通過結核菌快速檢測技術來提高結核菌的診斷率，以此達到盡快治療的效果。本文就結核菌快速檢測技術進行進展。

2.液體培養技術

在液體培養基中，結核桿菌的生長速度較快，且液體培養僅需要簡單的操作設備即可，方法原理簡單，世界衛生組織大量鼓勵全球中低收入國家采用液體培養方法。

（1）分枝桿菌快速手工培養技術

將熒光指示器鑲嵌在肉湯培養基試管底部，若指示器發出橙色熒光，那么就說明存在著結核菌，通過對比含抗結核藥管與生長對照管的熒光情況就可獲得細菌藥敏情況與生長情況。分枝桿菌快速手工培養技術檢測精確（檢出率高于90%），方法有效、簡單，只需7～14d就可得到檢測結果[4]。

（2）The BACTEC MGIT960自動培養技術

The BACTEC MGIT960自動培養技術的檢測原理與分枝桿菌快速手工培養技術相似，但需要由儀器來自動控制熒光信號的讀取，但是其最大的問題在于：一次性設備投入較大，應用面較窄[5]。

（3）The Bac T/Alert 3D系統技術

The Bac T/Alert 3D系統技術采用改良7H9 Middlebrook肉湯培養基，將比色傳感器鑲嵌在試管底部，試管對二氧化碳（由細菌代謝產生）的檢測靈敏度較高，試管顏色的變化可通過The Bac T/Alert 3D系統技術來予以24h實時持續檢測，待試管的顏色變為黃色之后，那么說明確實存在著結核菌。The Bac T/Alert 3D系統技術的檢測特異度與檢測靈敏度均較佳，尤其適用于快速培養結核菌的過程中，但對二線藥敏試驗報道不足。

（4）The Versa TREK系統技術

The Versa TREK系統技術采用7H9 Middlebrook肉湯培養基，通過培養容器內部的壓力變化情況來對細菌的生長情況予以實時掌握，無論是檢測過程，還是培養過程，均在同一培養容器中完成，但是目前國內外對于The Versa TREK系統技術的應用報道較少，還有待于在臨床上深入評估其實用性[6]。

（5）載玻片培養技術

首先，在滅菌載玻片一端放置十個樣品涂片，然后，再縱向切割玻片為兩半，分別放入液體培養基培養瓶內，其中將3瓶不含抗結核藥的培養瓶作為對照組，將含抗結核藥的培養瓶作為藥敏試驗組，培養24h候后再去除對載玻片進行固定干燥。只要有菌落出現在藥敏組中，那么就可以將其視為耐藥。載玻片培養技術的結果明確，培養原理簡單，但是安全性較差、操作繁雜。

3.固體培養技術

（1）TK培養基結核菌快速培養技術

培養基顏色會隨著結核桿菌的代謝活動予以變化，可基于培養基的顏色來判斷分枝桿菌是否生長。比常規培養技術相比，TK培養基結核菌快速培養技術的檢測時間會縮短10d，并且還能夠將常見的細菌污染予以排除，經濟可靠、原理簡單。

（2）噬菌體法檢測結核桿菌技術

噬菌體法檢測結核桿菌技術的檢測過程只需要3d，與涂片染色相比，其診斷敏感性略高一些，但是診斷敏感性比不上傳統培養法，可將其用于休眠期結核桿菌、活動期結核桿菌的檢測。

4.硝酸鹽還原酶測定(NRA)技術

檢測原理：硝酸鹽在結核桿菌的作用下會轉變成為亞硝酸鹽，這樣一來，就會導致試劑的顏色出現變化。硝酸鹽還原酶測定（NRA）技術是一種快速藥敏試驗方法，不僅價格便宜，而且還可用于檢測痰標本，測試利福平的敏感度為94%～100%，特異度為94%～100%；測試異煙肼的敏感度大于92%，特異度也大于92%；測試鏈霉素的敏感度為100%，特異度為100%；測試乙胺丁醇的敏感度為93%，特異度為100%，檢測時間最長為23 d。

E實驗：E實驗是一種快速藥敏實驗方法，能夠對多種藥物進行同時測試，但容易受到其他因素的污染和影響，較易出現較高的陰性率與假陽性率，會導致檢測費用大幅度增加，技術有待改進。

5.核酸擴增技術

臨床上對分枝桿菌種類進行鑒定的主要方法一直以來都是生化方法，不僅費時繁瑣、費時，而且還很難得到較為精確的檢驗結果。而后出現的Accuprobe試劑盒能夠對臨床標本進行直接鑒定，能夠利用DNA探針來對堪薩斯分枝桿菌、復合結核桿菌、胞內分枝桿菌、鳥結核分枝桿菌、戈登氏分枝桿菌等進行直接辨別，安全可靠。

6.GeneXpert技術

Gene Xpert屬于快速PCR檢測方法，主要優點在于診斷試劑盒和檢測系統的獨特設計以及兩者之間完美結合。工作人員只須按照配比將痰標本與處理液混合，靜置10min，然后再將混合液體滴入反應盒，再放入檢測模塊中，即完成手工操作過程。等待大約2h，檢測報告就可以打印出來。與傳統意義上的PCR設計不同，Gene Xpert采用的是geneXpert全封閉、全自動化的PCR檢測平臺，采取獨特的模塊設計，每個模塊都集成有獨立的檢測系統。

[1] 趙建宏, 李雅靜, 溫海楠, 等. 非結核分枝桿菌感染的分子診斷研究進展[J]. 檢驗醫學, 2012,18(3):120-125.

[2] 代旭磊, 柳愛華, 寶福凱, 等. 結核分支桿菌的分子檢測技術研究進展[J]. 現代預防醫學, 2012,19(8):110-114.

[3] 張朝寶, 王洪海, 張舒林. 結核分枝桿菌最低抑菌濃度測定方法及臨界值設置研究進展[J]. 上海交通大學學報(醫學版), 2012,30(5):130-135.

[4] 陳曼, 胡啟飛, 祝絢, 等. 肺結核快速檢測技術對肺結核的早期診斷[J]. 中華實用診斷與治療雜志, 2010,18(3):141-146.

[5] Devasia1 RA, Blackman A, May C, et al. Fluoroquinolone resistancein Mycobacterium tuberculosis:an assessment of MGIT 960,MODSand nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross-resistance[J]. J Antimicrob Chemother, 2009,63(6):1173-1178.

[6] Bwanga F, Haile M, Joloba ML, et al. Direct nitrate reductase assayversus microscopic observation drug susceptibility test for rapid detec-tion of MDR-TB in Uganda[J]. Plos One, 2011,50(3):109-115.

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