康復新液對TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎治療作用的研究

胡婷婷++饒朝龍++耿福能鄧青秀謝曉芳

【摘要】目的：觀察康復新液對2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的潰瘍性結腸炎模型大鼠的治療作用。方法：將60只SD大鼠隨機分為空白對照組（等體積蒸餾水）、模型對照組（等體積蒸餾水）、柳氮磺吡啶組（SASP，06g/kg）、康復新液高、中、低劑量組（20、10、5mL/kg），每組10只，雌雄各半。采用TNBS灌腸造模，造模后第3天開始灌胃給藥，連續12d，給藥結束后各組取材進行HE染色，并用ELISA法測定結腸組織中髓過氧化物酶（MPO）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-10（IL-10）的水平。結果：造模后大鼠結腸呈明顯潰瘍樣損傷；與空白對照組相比較，模型對照組大鼠結腸組織中促炎相關因子MPO、TNF-α和IL-1β的含量升高（P<005），抗炎因子IL-10含量降低（P<005）；與模型對照組比較，康復新液高劑量組大鼠結腸組織損傷減輕，高、中、低劑量組均能降低大鼠結腸組織中MPO、TNF-α含量（P<005），也有降低IL-1β含量和升高IL-10含量的作用趨勢。結論：康復新液對TNBS誘導的大鼠結腸炎具有良好的治療效果，機制可能與調節抗炎因子和促炎因子之間的平衡作用有關。

【關鍵詞】康復新液；2，4，6-三硝基苯磺酸；潰瘍性結腸炎；抗炎作用

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）21-0010-05

Experiment Study of Treatment Effects of Kangfuxin Solution on TNBS-Induced Ulcerative Colitis

HU Tingting1RAO Chaolong1GENG Fu neng2DENG Qingxiu1XIE Xiaofang1*

1Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Cheng du， 611137， China；2Good doctor pharmaceutical group， Xichang， 615000，China

Abstract：Objective To observe the therapeutic effects of Kangfuxin solution on rat model of ulcerative colitis induced by TNBS. Method sixty SD rats were randomly divided into six groups： nomal control groups， model groups， SASP groups， high-dose Kangfuxin groups， medium-dose Kangfuxin groups and low-dose Kangfuxin groups.Each groups have 10 rats including 5 male rats and 5 female rats.TNBS was instilled into the colon of rats to induce ulcerative colitis. 3 days after modeling， every groups were given relevant drugs once a day for 12d. On the day 12，after administration， the rats were sacrificed to collect colon specimens for HE staining. Elisa was performed to detect the levels of MPO， TNF-α， IL-1β andIL-10 in colon specimens of rat. Result Compared with nomal control groups， the contents of anti-inflammatory factors MPO， TNF-α， IL-1β in colon specimens of rats were significantly higher（P<005）， pro-inflammatory factor IL-10 was significantly reduced （P<005）. Kangfuxin solution can reduce the contents of MPO and TNF-α in colon specimens of rats（P<005） and has a certain influence on the IL-1β and IL-10. Conclusion Kangfuxin solution has a good therapeutic effect on rat model of ulcerative colitis induced by TNBS and its mechanism may be related to adjust the balance between anti-inflammatory factors and pro-inflammatory factors.

Keywords：Kangfuxin Solution； 2，4，6-Trinitro-Benzenesulfonicacid； Ulcerative Colitis； Anti-Inflammatory Effect

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病，臨床癥狀常以黏液膿血便、腹痛、腹瀉或里急后重為主，病情輕重不一，多呈反復發作；該病的治療難度大，且與結腸癌的發病有一定的關系[1]。近年來UC的發病率呈上升趨勢，并趨于年輕化。但本病的發病機制尚不清楚，目前認為主要與遺傳、免疫、感染、環境等因素有關[2]。UC的治療藥物以氨基水楊酸類藥物、腎上腺糖皮質激素類藥物和免疫抑制劑三類藥物為主，其中，氨基水楊酸類藥物為治療輕、中度UC的主要藥物，也是維持環節最有效的藥物，但毒副作用較大；腎上腺糖皮質激素是單一最有效的抑制急性活動性炎癥的藥物，但長期使用無維持作用；免疫抑制劑起效慢且毒性較大，主要的副作用是骨髓抑制[3]，因此開發更有效而低毒的治療UC的藥物迫在眉睫?？祻托乱菏敲乐薮篌垢稍锵x體的乙醇提取物，常以其干燥或鮮成蟲入藥，主要成分為多元醇類、肽類、表皮生長因子、粘多糖等活性物質[4]。研究表明[5]康復新液具有抗炎、消腫、促進細胞增殖和新生肉芽組織增長，加速病損組織修復，加快壞死組織脫落，迅速修復各類潰瘍及創傷創面，提高機體免疫功能等作用。免疫因素在潰瘍性結腸炎發病過程中發揮著重要作用，可觸發一個連續的慢性免疫過程，中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、T和B淋巴細胞等參與了該過程，這些效應細胞釋放的抗體、細胞因子和炎癥介質引起組織破壞和炎性病變[6]。因此，實驗擬通過觀察康復新液對TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用，探討康復新液治療潰瘍性結腸炎的可能機理，為潰瘍性結腸炎的臨床治療提供一定的理論依據。

1材料

11動物健康SD大鼠60只，SPF級，體重180～220g，雌雄各半，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（川）2013-19。

12[JP2]實驗藥物康復新液（批號：20140819，四川好醫生攀西藥業有限責任公司）為美洲大蠊干燥蟲提物，為淡棕色的液體，氣微腥臭、味甜。陽性藥物為柳氮磺胺吡啶（SASP，批號：09150508，上海信誼天平藥業有限公司）。[JP]

13實驗試劑水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號：CDBB6609V，購自Sigma公司）；無水乙醇（批號：2015031901，成都市科龍化工試劑廠）；MPO ELISA試劑盒（批號：21F013，依科賽生物科技（太倉）有限公司）；TNF-α ELISA試劑盒（批號：ERC102a）、IL-1β ELISA試劑盒（批號：ERC007）、IL-10 ELISA試劑盒（批號：ERC004）為欣博盛生物科技有限公司產品。

14試劑與藥物配制TNBS的配制：將TNBS按50g/L濃度用純水進行配制后與無水乙醇等體積混合；水合氯醛溶于生理鹽水配成10%的混合液；柳氮磺吡啶研磨碎后用純水配制成06g/kg；康復新液高劑量組為康復新液原液；康復新液中劑量為康復新液原液與純水按1∶1體積混合；康復新液低劑量為康復新液原液與純水按1∶3體積混合。

2方法

21動物模型復制參照文獻[7]的方法制作TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型。將禁食24h的大鼠用10%的水合氯醛3mL/kg的劑量進行腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠按仰臥姿勢固定在硬紙板上，將長12cm、直徑2mm左右的橡膠軟管管壁均勻抹上凡士林后輕柔緩慢的由大鼠肛門插入至結腸內約8cm處，將TNBS與無水乙醇混合液按80mg/kg劑量注入大鼠結腸內，注入完后輕緩的拔出膠管，為確保TNBS能在腸內分布均勻且不漏出，注入完成后讓大鼠呈倒立姿勢保持2min后再放回籠中，蘇醒后自由飲食進水。

22分組與給藥將健康SD大鼠正常飼養適應環境1周后，按體重隨機分為6組，即空白對照組（等體積蒸餾水）、模型對照組（等體積蒸餾水）、柳氮磺吡啶組（SASP，06g/kg）、康復新液高、中、低劑量組（20、10、5mL/kg），每組10只，雌雄各半。除空白對照組以外，其余五組按上述方法復制潰瘍性結腸炎模型，造模后第3天開始灌胃給藥，給藥體積20mL/kg灌，每天1次，連續給藥12d。實驗期間大鼠自由飲水和進食。

23標本取材及檢測末次給藥后禁食不禁水24h，用10%水合氯醛按03g/kg劑量腹腔注射麻醉后開腹，取出距肛門2cm以上8cm處結腸段，將其表面清理干凈后縱向剪開腸腔，用冰生理鹽水反復沖洗至干凈，用濾紙吸干水分，取病變處1cm左右用10%甲醛溶液中固定，常規脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察結腸形態學變化。剩余部分用冰生理鹽水制成10%的勻漿，采用酶聯免疫法測定結腸組織中MPO、TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。

24統計學分析采用SPSS190進行統計分析，結果用（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，首先對數據進行方差齊性檢驗，方差齊時多重比較采用LSD方法檢驗，如方差不齊時采用近似F檢驗Welch法進行方差分析，多重比較采用Dunnetts T3方法檢驗。P<005時差異有統計學意義。

3結果

31對大鼠一般行為的影響空白對照組大鼠毛色潔白光澤、緊密順貼，雙眼炯炯有神，活動敏捷自由，正常飲食進水，體重有明顯增加，大便呈長橢圓形顆粒。造模大鼠整體毛色較差，無光澤，不整潔，豎毛拱背，較萎靡，喜靜扎堆，飲食進水較少，大便排泄較少，肛門處有稀便粘附，給藥后部分大鼠上述情況有所改善。

32對結腸組織形態學的影響空白對照組大鼠結腸黏膜組織顏色呈淺紅色，粘膜表面光滑，黏膜皺襞清晰完整、邊緣清晰、寬窄厚薄均勻，未見出血點、潰瘍和糜爛。模型對照組大鼠結腸黏膜皺襞充血水腫、邊緣不清晰、可見增生隆起的結腸組織，腸壁增厚、寬窄不一、顏色變深、可見潰瘍或膿點。SASP組大鼠腸粘膜可見散在潰瘍，腸壁增厚、寬窄不一?？祻托乱焊邉┝拷M大鼠腸壁增厚，無明顯糜爛和潰瘍，偶見充血水腫；康復新液中劑量組和低劑量大鼠結腸顏色較紅，可見散在的潰瘍，組織充血水腫。各組大鼠結腸組織形態見圖1。

各組大鼠結腸組織經HE染色后，制成切片，在光學顯微鏡下進行觀察。

由圖2可知，空白對照組大鼠結腸組織結構完整，形態清晰，黏膜表面平滑，腺體分布規則，肌層和漿膜層無異常，且無炎癥、充血、水腫及壞死現象（A）。模型對照組大鼠黏膜層及黏膜下層伴炎性浸潤，可見杯狀細胞減少，局灶黏膜淋巴組織增生，黏膜下層和內環行肌之間間隙增寬，外縱行肌下層炎性浸潤，血管充血擴大（B），腸壁全層炎癥，黏膜糜爛脫落、潰瘍形成，局灶腺體輕度不典型增生（C）。與模型對照組相比較，SASP組大鼠黏膜層形態結構較完整，杯狀細胞增加，黏膜下層伴有少量中性粒細胞及淋巴細胞（D）?？祻托乱焊邉┝拷M黏膜層結構較完整，黏膜層及黏膜下層炎癥減輕，中性粒細胞減少，黏膜下層水腫減輕（E）?？祻托乱褐袆┝拷M黏膜層處于修復期，有新生肉芽組織生成，黏膜下層水腫程度減輕，中性粒細胞減少，有較多新生血管（F）?？祻托乱旱蛣┝拷M黏膜層處于修復期，有新生肉芽組織生成，黏膜下層及內環行肌層炎性程度減輕（G）。

33對大鼠結腸組織中炎癥因子含量的影響與空白對照組相比較，模型對照組大鼠結腸組織中MPO含量增加，差異具有統計學意義（P<005）；與模型對照組相比較，SASP組和康復新液各劑量組大鼠結腸組織中MPO含量降低，差異具有統計學意義（P<005）。與空白對照組相比較，其余各組大鼠結腸組織中TNF-α含量均增加，差異具有統計學意義（P<005），與模型對照組相比較，SASP組和康復新液各劑量組大鼠結腸組織中TNF-α含量降低，差異具有統計學意義。（P<005）。詳見表1。

與空白對照組相比較，模型對照組大鼠結腸組織中IL-1β含量增加，差異具有統計學意義（P<005）；與模型對照組相比較，康復新液各劑量組大鼠結腸組織中IL-1β含量有所減少，但差異無統計學意義（P>005）。與空白對照組相比較，各組大鼠結腸組織中IL-10含量均減少，差異具有統計學意義（P<005）；與模型對照組相比較，SASP組以及康復新液各劑量組大鼠結腸組織中IL-10含量增加，但差異無統計學意義。詳見表2。

4討論

由TNBS誘導的潰瘍性結腸炎動物模型與人類結腸炎具有相似之處，常用于研究人類潰瘍性結腸炎的發病機制和結腸炎藥物評價[8]。潰瘍性結腸炎的病變以潰瘍和炎性細胞的浸潤為主，中性粒細胞是急性炎癥反應的主要炎癥細胞，也是第一個到達損傷組織的炎癥細胞[9]。MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的一種重要的過氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細胞以及單核細胞中，其活性高低是判斷中性粒細胞浸潤程度的重要指標，也是結腸炎嚴重程度的指標[10-11]。本次實驗發現，模型組MPO活性明顯高于空白組，SASP和康復新液可顯著降低大鼠結腸組織中MPO含量，20mL/kg劑量的康復新液可使其明顯恢復，進一步說明了康復新液對TNBS引起的大鼠潰瘍性結腸炎具有治療作用。TNF-α由活化的T淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞產生，在潰瘍性結腸炎的發病中起到重要作用（P<005）。TNF-α和NF-κB可相互作用，能刺激單核巨噬細胞和中性粒細胞等合成IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子，并能刺激肥大細胞分泌IL-12[12-13]。此外，TNF-α可使潰瘍性結腸炎患者腸上皮內的淋巴細胞增殖、分化和移行，并釋放炎性介質，對周邊腸粘膜產生破壞，使結腸潰瘍加重和延續[14]。在本實驗中，模型組大鼠結腸組織中TNF-α含量明顯高于空白大鼠結腸組織中TNF-α含量，SASP和康復新液可降低TNBS引起的大鼠結腸組織中TNF-α增加，且SASP和20mL/kg的康復新液具有較明顯的效果（P<005），證明康復新液治療潰瘍性結腸炎的作用機制與下調TNF-α有一定的關系。IL-1β是一種由單核巨噬細胞產生的重要細胞因子和多肽調節因子，能促進血管內皮-白細胞黏附因子的表達，趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道部位，從而引起一系列腸道炎癥反應和損傷，其升高程度可反應疾病的嚴重程度[15]。IL-10主要由Th2細胞分泌，是一種抗炎細胞因子，有免疫調節和抗炎作用，可下調活化的單核細胞和巨噬細胞轉錄分泌TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β等促炎因子[16]。實驗中，與空白組相比較，模型組大鼠結腸組織中IL-1β含量顯著升高而IL-10含量顯著降低（P<005），同時SASP和康復新液具有一定下調IL-1β的表達并提高IL-10水平的作用。

由此可知，康復新液對于潰瘍性結腸炎的治療作用與其降低MPO的活性和TNF-α、IL-1β含量并升高IL-10含量，調節抗炎細胞因子和促炎細胞因子之間的平衡有一定的關系，且本實驗顯示，康復新液高劑量與SASP對于潰瘍性結腸炎的治療具有相似效果，但SASP屬于氨基水楊酸類藥物，相比于SASP較大的副作用，康復新液更為安全有效，這為其臨床具體的應用提供了實驗依據。

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（編輯：梁志慶）