內蒙古西部赤霞珠葡萄自然發酵酵母菌群的動態變化

王鳳梅++馬利兵

摘要：在無菌條件下，對內蒙古西部地區赤霞珠葡萄汁進行自然發酵，分別在發酵初、中、后期分離酵母菌株，采用WL營養瓊脂對其進行形態學分類，采用基于酵母5.8S rRNA-ITS區域的RFLP（restriction fragment length polymorphism）分析對分類酵母菌株進行分子生物學鑒定，統計不同發酵時期發酵液中酵母菌株的種類及數量。結果表明，分離到的327株酵母菌分屬于5個屬的5個酵母菌種，分別是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克魯維畢赤氏酵母（Pichia kluyveri）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）及葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；自然發酵初期，葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤氏酵母的數量占據優勢，分別占分離總菌株數的64.22%、17.43%；隨著發酵進行，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）菌株的數量有所減少，釀酒酵母的數量逐漸增加，至發酵后期，發酵液中僅能檢測到釀酒酵母的存在。這表明內蒙古西部地區野生酵母菌種較為豐富，WL營養瓊脂形態學分類法結合酵母5.8S rRNA-ITS區域的RFLP分析能夠快速分類、鑒定野生酵母菌種，實時監測發酵液中酵母菌群的動態變化趨勢。

關鍵詞：葡萄酒；酵母；赤霞珠；WL營養瓊脂；動態變化

中圖分類號： S182；TS262.61文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0340-04

收稿日期：2015-08-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160245）。

作者簡介：王鳳梅（1975—），女，河北定縣人，碩士，副教授，主要從事發酵微生物研究。E-mail：maywfm@126.com。

通信作者：馬利兵，博士，教授，主要從事細胞工程及基因工程研究。E-mail：mlb-xn2004@163.com。葡萄表面、葡萄園土壤、葡萄酒廠乃至釀酒設備上存在著大量與葡萄酒發酵有關的天然酵母菌種[1]。在這些酵母菌種中，酵母屬（Saccharomyces）在發酵過程中起主要作用，發酵力較強，產酒精多，產生的有益副產物多；而非酵母屬（non-Saccharomyces）在葡萄汁中數量較多，能啟動發酵，但其發酵力相對較弱[2]。在傳統的葡萄及葡萄酒產區，一些天然酵母菌種在每年生長、繁殖過程中逐漸適應了當地的氣候及土壤條件，并與當地葡萄品種形成良好的共生關系，再經自然選擇作用形成適應于不同類型葡萄酒的酵母菌系[3]。對天然酵母種群的研究報道表明，絕大多數情況下，葡萄品種、地理位置及氣候條件等會影響天然酵母的菌群及其數量[4]。

內蒙古西部地區屬中溫帶半干旱大陸性氣候，干旱少雨，日照充足，晝夜溫差大，有效積溫高，是我國優質的釀酒葡萄產區。本研究采用WL營養瓊脂形態學分類法，結合酵母 5.8S rRNA-ITS區域的RFLP（restriction fragment length polymorphism）分析，對內蒙古西部地區赤霞珠葡萄中的酵母菌種進行分類、鑒定，確定該地區天然酵母菌群的種類，探究自然發酵過程中天然酵母菌群的動態變化趨勢，為該地區葡萄酒發酵工藝控制及后續優良釀酒酵母篩選提供理論及技術依據。

1材料與方法

1.1菌種分離

1.1.1培養基YPD培養基（yeast extract peptone dextrose medium）[5]：酵母浸粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，固體培養基中需添加2%瓊脂、0.01%氯霉素。WL瓊脂培養基（wallerstein laboratory nutrient agar）配方[6]：酵母浸粉0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、硫酸鎂0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸錳0.000 25%、溴鉀酚綠0.002 2%，pH值為5.5。

1.1.2自然發酵過程中酵母的分離赤霞珠來源于內蒙古西部阿拉善盟釀酒葡萄產區，選取成熟的赤霞珠果粒，無菌條件下破碎，轉入1 L的無菌玻璃容器內，室溫下進行自然發酵；分別在自然發酵前期（瓶底部有少量氣泡產生，發酵啟動）、中期（大量氣泡上升，發酵旺盛）及后期（無明顯氣泡上升，發酵消退期）取發酵液，經梯度稀釋，涂布于YPD平板上，28 ℃培養3 d；結合菌落顏色及形態挑取菌落，對挑取的單個菌落以劃線方式在YPD平板上進一步分離、純化。

1.2分離菌種的形態學分類

將各時期分離的酵母菌株劃線接種于WL培養基上，28 ℃ 培養5 d，觀察記錄菌落的顏色、形態，并對其進行分類，統計不同發酵時期不同酵母菌株的數量。

1.3酵母菌種的分子生物學鑒定

對經形態學鑒定的酵母菌種，參照Esteve-Zarzoso等的方法[7-8]，進一步進行5.8S rRNA-ITS區域RFLP分析。采用天根生化科技（北京）有限公司生產的酵母基因組提取試劑盒，按試劑盒說明書提取酵母菌的基因組DNA，-20 ℃凍存、備用；采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對不同酵母菌株的 5.8S rRNA-ITS區域進行PCR擴增。PCR反應體系為：模板DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10×PCR buffer 5 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，dNTP混合液1 μL，超純水40 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火2 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物分別采用由寶生物（大連）有限公司生產的限制性核酸內切酶HinfⅠ、HaeⅢ及HhaⅠ于37 ℃條件下酶切16 h，酶切反應體系為：PCR擴增產物10 μL，10×buffer 2 μL，限制性核酸內切酶2 μL，超純水6 μL。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，在凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

2結果與分析

2.1WL培養基上酵母菌株的聚類分析

從赤霞珠自然發酵的葡萄汁中共分離、純化出327株酵母菌，將所有菌株劃線接種于WL培養基上繼續進行培養，觀察酵母菌株在WL培養基上的菌落顏色及形態。根據不同酵母菌種在WL培養基上呈現的不同菌落顏色及形態（圖1、表1），將分離純化的327株酵母菌分為5類。

2.2酵母5.8S rRNA-ITS區域的RFLP分析

分別提取5種類型酵母菌的基因組DNA，以ITS1/ITS4為引物對其5.8S rRNA-ITS區域進行PCR擴增，擴增產物分別用Hif、HaeⅢ及HhaⅠ進行酶切，經凝膠電泳檢測，共有5種不同的酶切類型，見圖2、表2。通過與Esteve-Zarzoso等研究結果[7-10]進行比對分析，確定Ⅰ至Ⅴ類型酵母菌種分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.3不同發酵時期酵母菌的種群分布

由圖3可見，不同發酵時期的發酵液中，不同酵母菌種的分布存在很大差異；發酵前期，分離到的菌株為釀酒酵母、東方伊薩酵母、克魯維畢赤氏酵母、淺黃隱球酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母，分別占分離總菌株的2.75%、9.17%、17.43%、6.42%、64.22%，葡萄汁有孢漢遜酵母是這一時期的優勢酵母菌，其次是克魯維畢赤酵母，釀酒酵母、東方伊薩酵母及淺黃隱球酵母檢出量相對較少；發酵中期，發酵液中葡萄汁有孢漢遜酵母的數量銳減，其他非釀酒酵母的數量也有所減少，而釀酒酵母隨發酵的進行逐漸占據優勢地位；發酵后期，發酵液中僅能檢測到釀酒酵母的存在。

3結論與討論

酵母菌普遍存在于葡萄果實、葉片、根系以及葡萄園土壤顆粒中，葡萄果實表面是各種酵母菌的天然棲息地，其上分布的酵母菌數量尤為可觀。葡萄汁在發酵過程中，酵母菌群種類及其數量處于動態變化中，不同酵母菌群有規律地此消彼長，發酵力強的釀酒酵母比例會逐漸上升，發酵力弱的酵母比例會迅速下降。近些年，有關葡萄發酵過程中酵母菌群的動態變化國內外已做了大量研究與報道，結果表明，在葡萄漿果表面占主導地位的酵母主要為葡萄汁有孢漢遜酵母屬、假絲酵母屬（Candida）及畢赤酵母屬（Pichia）等，這些非釀酒酵母在發酵初期占據優勢；隨著發酵的進行，非釀酒酵母的數量會逐漸減少，直至消失，而耐酒精能力更強的酵母屬酵母會逐漸增多，直至占據主導地位；發酵結束，發酵液中存活的幾乎全部是酵母屬酵母[11-14]。本試驗得到同樣一致的結論，這說明不同葡萄產區的天然酵母雖然存在種屬差異，然而，葡萄汁在發酵過程中，天然酵母種群的變化趨勢是相同的。

本試驗中使用的WL培養基是一種非選擇性培養基，該培養基最初由Wallerstein實驗室設計，用于檢測飲料中的微生物菌群。國內外研究表明，使用WL培養基能夠實現基于菌落的顏色及形態對酵母菌進行分類，該培養基對自然發酵過程中葡萄汁中分離到的酵母菌種具有良好的鑒別能力[6，13，15]。Pallmann等采用WL營養培養基對發酵過程中發酵液的酵母菌種進行分類，采用26S rDNA測序技術對分類結果進行驗證，結果表明，WL營養瓊脂培養基可用于監測發酵液中酵母菌群的動態變化趨勢[16]。楊瑩等也采用WL營養培養基對葡萄酒相關酵母菌種進行分類，采用酵母5.8S-ITS區及26S rDNA D1/D2區擴增與測序技術對分類結果進行驗證，結果表明，WL營養瓊脂與分子生物學的鑒定結果相一致[13]。因此，WL營養瓊脂能對葡萄酒相關酵母進行分類，此法經濟簡單、易行。

親緣關系相近的菌種，其5.8S rRNA序列很相似，但其兩側的間隔序列（ITS）由于相對較快的進化速率，而具有長度和序列上的高度變異性，可以提供豐富的變異位點和信息位點。因此，采用酵母菌種5.8S rRNA-ITS區的RFLP分析，可作為鑒別酵母菌種的依據[6]。Esteve-Zarzoso等首次建立了132種酵母的RFLP分析圖譜數據庫，并確定5.8S rRNA-ITS擴增片段的RFLP分析在種的水平上鑒定酵母的有效性[6]。此后，該數據庫得到不斷的補充和完善[7-9]，Echeverrigaray等使用該方法鑒定出巴西葡萄酒中的非酵母屬敗壞酵母[17]，U'beda等也采用5.8S rRNA-ITS區RFLP分析及26S rDNA D1/D2區擴增與測序技術研究西班牙La Mancha地區葡萄酒廠的非酵母屬的多樣性[18]。

早期的研究一般認為，葡萄汁有孢漢遜酵母的發酵力低，能生成較多的醋酸及乙酸乙酯，對葡萄酒的整個釀造過程具有負面影響[19]。然而，近期研究表明，有孢漢遜酵母屬中的部分菌株能生成大量的酯類、甘油及β-葡萄糖苷酶，對葡萄酒的化學成分和最終感觀有著積極影響[20]。Longo等認為，隨著發酵力低的克勒克酵母屬、有孢漢遜酵母屬及其他一些屬酵母如畢赤酵母屬、假絲酵母屬等的發酵啟動，耐酒精能力強的釀酒酵母會逐步占據優勢，主導發酵的完成[21]。本試驗在無菌環境下對內蒙古西部地區采集到的赤霞珠進行自然發酵，通過分析不同發酵時期酵母菌群的動態變化過程，一方面證明發酵液中存在大量的野生釀酒酵母，發酵初期，發酵液中能分離到少量的克魯維畢赤酵母、釀酒酵母、東方伊薩酵母及淺黃隱球酵母，葡萄汁有孢漢遜酵母在發酵早期為優勢菌株，另一方面，結果表明，在發酵中期，非釀酒酵母的數量銳減，釀酒酵母的數量逐漸占據優勢，分析其原因在于：隨著發酵的進行，發酵液中的酒精濃度逐漸升高，非釀酒酵母由于較低的酒精耐受力而使生長受到抑制，甚至死亡，而釀酒酵母的酒精耐受力較強，仍可大量增殖，此消彼長，最終導致發酵中期的發酵液中酵母菌群的數量發生根本性改變，且這一過程持續進行，直至發酵末期，發酵液中僅能分離到釀酒酵母。

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