橡膠樹種子的體外抗菌活性研究

石舒瑾　崔麗麗　王金梅

【摘 要】目的：研究橡膠樹種子對3種臨床常見菌株的抗菌活性。方法：采用紙片擴散法測定橡膠樹種子各部位浸膏的抑菌圈。結果：橡膠樹種子乙酸乙酯部位和正丁醇部位對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產超光譜β-內酰胺酶金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均>6 mm。結論：橡膠樹種子有一定的抗菌活性，且其乙酸乙酯部位和正丁醇部位在濃度為50 mg/mL抗菌活性相當，石油醚部位則沒有抗菌活性。

【關鍵詞】橡膠樹種子 抗菌活性 紙片擴散法

橡膠樹Hevea brasiliensis （Willd.ex A.Juss.） Muell.Arg.為大戟科橡膠樹屬植物，原產巴西，現廣泛栽培于亞洲熱帶地區，我國臺灣、福建等地均有栽培，以海南和云南種植較多，本種是最主要的天然橡膠植物[1]。橡膠樹具有很高的經濟價值，是制備天然橡膠的材料，廣泛用于工業、國防、醫藥衛生等領域。橡膠樹種子也有很高的應用價值，種仁含油量高達45%～55%，主要成分有豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸等[2]。研究表明[3-5]，橡膠樹種子能夠降血脂，還能改善家兔主動脈動脈粥樣硬化病變。然而對橡膠樹的研究多集中在基因組學方面，藥學方面的研究很少[6-7]。

本試驗采用紙片擴散法對橡膠樹種子的抗菌活性進行了初步研究，以期豐富橡膠樹的研究開發。

1 儀器和材料

1.1 儀器

JJ-CJ-2FD超潔凈工作臺（吳江市凈化設備總廠）；GRP-9720恒溫隔水式培養箱（上海森信試驗儀器有限公司）；ZWY-211C恒溫臥式培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；ZWX-201A紫外線空氣消毒器（廣東粵華醫療器械廠）；渦旋器；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑

營養肉湯，營養瓊脂（北京奧博星生物技術有限公司）；青霉素G（Penicillin G.K-salt：C16H17N2O4SK），activity：156U/mg，25mg；硫酸鏈霉素（Streptomycin suifate research grade： C21H39N7O12 1.5H2SO4），activity：759U/mg，10mg（購買于SERVA公司）；DMSO，1，3-丙二醇，無水乙醇（均為分析純）。

1.3 供試菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），產超光譜β-內酰胺酶金黃色葡萄球菌（Extended spectrum β-lactamases Staphylococcus aureus，ESBLs-SA），所有菌株均為河南大學淮河醫院臨床分離菌株，經全自動微生物分析儀VITEK-AMS鑒定，符合率≥99%。

1.4 藥材

橡膠樹種子于2014年11月采集于海南省萬寧市興隆鎮，由河南大學中藥研究所李昌勤教授鑒定為大戟科橡膠樹（H. brasiliensis）的種子。標本現存于河南大學中藥研究所。

2 方法

2.1 液體和固體培養基的配置

營養肉湯培養基配制：稱取營養肉湯干粉18g，用1000mL蒸餾水溶解，分裝于錐形瓶中，于121℃，0.15MPa下滅菌15min，備用。

營養瓊脂培養基配制：分別稱取瓊脂干粉15 g和營養肉湯干粉18g，用1000mL蒸餾水加熱溶解，分裝于錐形瓶中，于121℃，0.15 MPa下滅菌15min后，立刻將滅菌瓊脂分裝于無菌平皿中，備用。

2.2 菌懸液的制備

將臨床分離鑒定后的SA、MRSA、ESBLs-SA進行菌株擴大培養，平板劃線法接種在瓊脂平皿中，37℃培養18 h，用接種環取出單個菌落2個，接種在100 mL滅菌肉湯中，于120 r/min、37℃恒溫搖床培養至對數生長期，酶標儀測定吸光度值，用新鮮滅菌的肉湯將菌液稀釋至吸光度值為0.1，稀釋后菌液約為1×108 CFU/mL，現配現用。

2.3 樣品的制備

取橡膠樹種子650g，用70%乙醇浸漬提取3次，每次3天，合并提取液，濃縮得到浸膏（68g），將浸膏用水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，分別得到石油醚部位（8g）、乙酸乙酯部位（18g）、正丁醇部位（10g）。分別稱取適量各部位浸膏加適量DMSO溶解，配成50mg/mL溶液，備用。

2.4 抑菌圈的測定

采用紙片擴散法測定橡膠樹種子的抗菌活性。按照文獻[8]的方法，用微量加樣器吸取5μL樣品加到直徑為6mm濾紙片上，揮干溶劑后，等距貼于含菌平板上，用溶劑做空白對照，用硫酸鏈霉素和青霉素G做陽性對照（濃度為4 mg/mL），于37℃恒溫培養箱內培養18h，記錄抑菌圈直徑。每份樣品均平行操作3次，結果取平均值。所有操作均在無菌條件下進行。

3 結果

本文章采用紙片擴散法考察了橡膠樹種子石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對三種金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結果采用算術平均值和標準差表示，數值統計采用SPSS19.0軟件單因素方差分析法（One-Way ANOVA）比較其顯著性差異，具體結果見表1。

4 討論

由表1可以看出，橡膠樹種子乙酸乙酯部位和正丁醇部位在濃度為50 mg/mL對SA、MRSA、ESBLs-SA均有一定的抑制活性，與陽性對照青霉素G和硫酸鏈霉素相比，二者抗菌活性均弱于陽性對照，結果具有顯著性差異（*P≤0.5，***P≤0.001）。橡膠樹種子石油醚部位則沒有顯示抗菌活性，說明橡膠樹種子的抗菌活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

橡膠樹的應用價值眾所周知，早在90年代，就有人預測橡膠樹可能成為未來的藥物工廠，能用于生產胰島素疫苗，抗血栓藥物等[9]。目前橡膠樹的研究主要集中在基因組學、蛋白質組學等生物信息學的研究，取得了很大成就[10-12]。本文從藥學的角度對橡膠樹種子進行研究，豐富了橡膠樹的研究內容。

參考文獻：

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[11]朱晉恒，戚繼艷，肖小虎，唐朝榮.巴西橡膠樹葡萄糖/核糖醇脫氫酶基因的克隆和表達分析[J].熱帶作物學報，2016，06：1-9.

[12]康桂娟，黎瑜，曾日中.巴西橡膠樹HbNAM基因克隆和表達分析[J].南京林業大學學報（自然科學版），2016，01：59-64.