響應面法優化超聲輔助提取蕎麥中蘆丁的工藝

黃菊+史小琴

摘要：為優化超聲輔助乙醇浸提蕎麥（Fagopyrum esculentum）中蘆丁的工藝條件，利用響應面法優化蕎麥蘆丁提取工藝，以蘆丁提取量為指標，通過單因素試驗和響應面試驗探討超聲時間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分數對提取量的影響。結果表明，獲得的最佳工藝為超聲時間23 min、超聲溫度79 ℃、液料比30∶1（mL∶g）、乙醇體積分數90%。交互作用影響顯著的因素為超聲時間與乙醇體積分數、超聲溫度與乙醇體積分數。在此條件下進行驗證，蕎麥蘆丁的提取量為0.416 1 mg/g，與模型預測值0.428 8 mg/g基本相符。模型可以較好地預測蕎麥蘆丁的提取量，響應面法對蕎麥蘆丁提取條件參數優化具有可行性。

關鍵詞：蕎麥（Fagopyrum esculentum）；超聲波；蘆??；響應面法

中圖分類號：S517；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5327-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.040

Abstract： In order to optimize the technological condition of ultrasonic-assisted ethanol extraction of rutin from Fagopyrum esculentum， taking the yield of rutin as the index， The effects of four main variables， i.e.， ultrasound time， ultrasound temperature， liquid-solid ratio and percentage of ethanol concentration on the extraction yeild of rutin were discussed by single-factor experiments， the optimal process of extracting rutin from Fagopyrum esculentum were obtained by response surface methodology. The results showed that， the optimum extraction conditions were as follows： extraction time of 23 mins， extraction temperature of 79 ℃， liquid-solid ratio of 30∶1 and ethanol concentration of 90%. The interactions were prominent between ultrasound time and ethanol concentration， also between extraction temperature and ethanol concentration. Under these conditions， a mean value of 0.416 1 mg/g（n=3） was observed， which was well matched with the predicted value of 0.428 8 mg/g. The proposed prediction model could accurately predict the extraction yield of rutin， which suggested it was feasible to optimize the extraction conditions of rutin from Fagopyrum esculentum using response surface methodology.

Key words： Fagopyrum esculentum； ultrasonic； rutin； response surface methodology

蕎麥（Fagopyrum esculentum）中含有大量的黃酮類化合物，其醇提物的主要成分為蘆丁[1]。它具有顯著的降糖功效，因而受到糖尿病患者的青睞，并被廣泛用于降糖食品的研究開發[2]。從蕎麥中提取蘆丁的方法有索氏回流提取、熱水浸提法和堿提酸沉等，賈冬英等[3]進行了系統的對比研究，認為乙醇浸提法操作簡單，溶劑可回收、無毒害，是行之有效的提取方法。但在實際應用中因時間長、能耗大等因素限制了其工業化生產。而隨著分離技術的進步，超聲波、微波和超臨界萃取等輔助提取天然植物中有效成分的新方法不斷發展起來，在一定程度上縮短時間，節約了能耗，從而達到了提高生產效率的目的。超聲波提取技術是利用超聲波產生的機械騷動效應、熱學效應和空化效應等物理化學過程來加速物質的擴散溶出而提高提取效率的一種較實用的提取方法[4，5]。將超聲波用于蕎麥黃酮的提取已有研究，文獻[6-9]選擇的原材料均為蕎麥麩皮，優點是蕎麥麩皮中黃酮類化合物含量較高，能夠得到較高的提取率，但大量收集蕎麥麩皮也存在一定困難。陳國安等[10]直接以蕎麥為原料，采用響應面法確定了超聲輔助提取蕎麥黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數50%，超聲溫度35 ℃，超聲時間30 min，液固比45∶1（mL∶g），此時，苦蕎黃酮提取率為6.92%。

本研究擬在借鑒現有研究的基礎上，利用超聲波輔助乙醇浸提蕎麥中的蘆丁，通過響應面試驗對提取工藝參數進行優化，對獲得的蕎麥蘆丁提取工藝模型進行深入分析，并討論雙因素間的交互作用，以期為蕎麥蘆丁的開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥產地為山東棗莊；蘆丁標準品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ5200DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；722型可見分光光度計（配有1 cm比色皿）（上海悅豐儀器儀表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DHG-9070A型鼓風干燥箱（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥中蘆丁的提取 蕎麥→干燥粉碎→過30目篩→乙醇預先浸泡→超聲輔助提取→抽濾→濾液定容待測。

1.3.2 標準曲線的繪制 稱取10 mg蘆丁標準品溶于50 mL容量瓶中配制成0.2 mg/mL的標準儲備液。然后分別移取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL于25 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min， 10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min。配制成0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的蘆丁標準液，于510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）對濃度（c）繪制標準曲線，經最小二乘法得到標準曲線方程：A=7.775c+0.017 6，R2=0.994 5。說明在 0～0.10 mg/mL吸光度和蘆丁濃度呈良好的線性關系。

1.3.3 蕎麥蘆丁含量測定 從蕎麥蘆丁的提取液中移取2 mL于25 mL容量瓶中，滴加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，然后滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，定容至刻度，搖勻靜置15 min后，于510 nm波長處測定吸光度。

式中，A為提取液吸光度；V0為蕎麥蘆丁提取液定容體積，mL；V1為蕎麥蘆丁提取液定容后吸取的體積，mL；V2為蕎麥蘆丁稀釋液定容體積，mL；m為蕎麥粉樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

1）超聲時間。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲溫度80 ℃、液料比30∶1（mL∶g，下同）和90%乙醇條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50 min。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察超聲時間對蘆丁提取量的影響。

2）超聲溫度。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時間20 min、液料比30∶1和90%乙醇條件下，按照超聲溫度40、50、60、70、80 ℃進行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察超聲溫度對蘆丁提取量的影響。

3）液料比。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時間20 min、超聲溫度80 ℃和90%乙醇條件下，按照液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1進行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察液料比對蘆丁提取量的影響。

4）乙醇體積分數。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時間20 min、超聲溫度80 ℃和液料比30∶1的條件下，分別按照乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%進行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察乙醇體積分數對蘆丁提取量的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗設計 根據單因素試驗結果，以上述4個因素為考察變量，蘆丁提取量為響應值，利用Box-Behnken設計方法進行響應面試驗設計，試驗設計采用Design-expert 8.0.6軟件進行，試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對提取量的影響 如圖1所示，蘆丁提取量隨著超聲時間的增加先增后減，在20 min左右形成拐點，分析可能是因為隨著超聲時間的延長，由于存在強烈的振動和熱效應，使得蘆丁結構部分被破壞，導致提取量減少。因此以超聲時間20 min為宜。

2.1.2 超聲溫度對提取量的影響 由圖2可知，40～70 ℃范圍內隨著超聲溫度的增加，蘆丁提取量增加，超過70 ℃后，提取量下降。這主要是因為提高溫度有利于黃酮類化合物的溶出，但溫度過高，會使得提取液中的有效成分被破壞，且雜質的溶出量也增加，從而蘆丁提取量減少，因此最佳的超聲溫度為70 ℃左右。

2.1.3 液料比對提取量的影響 由圖3可知，隨著液料比地增加，蘆丁提取量先增后減，在30∶1時達到最大值，而后趨于平穩略有下降?？紤]到節約溶劑量的因素，以液料比30∶1為宜。

2.1.4 乙醇體積分數對提取效果的影響 如圖4所示，隨著乙醇體積分數的增加，蘆丁提取量也不斷增加，達到80%～90%時，增加量逐漸平穩，因此以80%乙醇為宜。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken設計原理，對超聲時間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分數進行四因素三水平的響應面試驗，結果見表2。

采用Design-expert 8.0.6進行多元回歸擬合，得到響應值蕎麥蘆丁提取量（Y）對編碼自變量超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、液料比（X3）和乙醇體積分數（X4）的二次多項回歸方程：

Y=0.37+0.038X1+0.022X2+0.023X3+0.034X4-0.014X1X2-5.05×10-3X1X3+0.067X1X4-9.4×10-3X2X3+0.073X2X4-4.3×10-3X3X4-0.027X12-0.040X22-0.059X32-0.11X42，對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。由表3可知，該模型的F=14.96，P<0.000 1，說明二次回歸方程是極顯著的，失擬項F=0.32，P=0.932 9，表明相對于純誤差，失擬現象不顯著。模型的確定系數R2=0.937 3，反映了回歸方程對響應值的解釋能力為93.73%，而在多元回歸擬合中，自變量個數對方程擬合的優度有影響，一般還需考慮調整確定系數R2Adj，本例中為0.874 7，它表明響應值的總變異中有87.47%可由所選的4個獨立變量來解釋。模型變異系數為10.46%，表明模型具有較高的可靠性和精確性。綜上可知，該模型具有顯著的統計學意義，可以用于蕎麥蘆丁提取工藝的優化。

從單因素的F值看出，各單因素對蘆丁提取量的影響順序為：超聲時間>乙醇體積分數>液料比>超聲溫度。此外，P（X1X4）和P（X2X4）都小于0.005，表明兩因素的相互作用中，超聲時間和乙醇體積分數、超聲溫度和乙醇體積分數對蕎麥蘆丁提取量具有顯著的交互作用，其余兩因素間的交互作用不顯著。

2.3 雙因素間的交互影響作用分析

雙因素間的交互影響因素可以從響應曲面圖上直觀的觀察，曲面圖坡度越陡峭，說明雙因素交互作用顯著，反之，坡度平緩則不顯著。從圖5可以看出，c和e的響應曲面比較陡峭，說明超聲時間和乙醇體積分數、超聲溫度和乙醇體積分數對蕎麥蘆丁提取量具有顯著的交互作用，在此將交互作用顯著的雙因素影響的等高線圖列出，如圖6所示。從圖6（左）可以看出，當超聲時間較短時，蘆丁提取量隨著乙醇體積分數的增加先增后減，當超聲時間較長時，提取量隨著乙醇體積分數增加而增加；當乙醇體積分數較低時，提取量隨著超聲時間的增加略有下降；當乙醇體積分數較高時，提取量隨著超聲時間的增加而增加。并且乙醇體積分數地影響大于超聲時間對提取量地影響。因此，適當地增加乙醇體積分數并選擇合適的超聲時間，可以有效提高蘆丁提取量。

同理，圖6（右）可以看出，當超聲溫度較低時，提取量隨著乙醇體積分數的增加先增后減，當超聲溫度較高時，提取量隨著乙醇體積分數的增加而增加；當乙醇體積分數較低時，提取量隨著超聲溫度的增加變化不明顯，當乙醇體積分數較高時，提取量隨著超聲溫度地增加而增加，且乙醇體積分數對提取量的影響大于超聲溫度對提取量的影響。因此，選擇適當增加乙醇體積分數，并選擇合適的超聲溫度有利于提高蕎麥蘆丁的提取量。

根據響應面分析結果可得超聲輔助乙醇提取蕎麥中蘆丁的最佳工藝參數為：超聲時間23 min，超聲溫度78.66 ℃，液料比30.20∶1，乙醇體積分數89.67%，此時蘆丁的理論提取量為0.428 8 mg/g。根據上述結果考慮實際情況，調整工藝參數為超聲時間23 min，超聲溫度79 ℃，液料比30∶1，乙醇體積分數90%，進行3次驗證試驗，得到蘆丁的平均提取量為0.416 1 mg/g（RSD=1.89），比理論提取量低2.96%，表明響應面法對蕎麥蘆丁提取工藝的優化具有可行性。

3 結論

研究選擇超聲時間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分數4個對蕎麥蘆丁提取量影響較大的因素進行響應面試驗，建立了相應的二次回歸方程。方差分析和響應曲面分析表明，4個因素及其二次項對蕎麥蘆丁提取量具有顯著影響，同時乙醇體積分數分別與超聲時間和超聲溫度的交互影響顯著。

蕎麥蘆丁最佳的超聲提取工藝為：超聲時間23 min，超聲溫度79 ℃，液料比30∶1，乙醇體積分數90%，驗證試驗得到的蘆丁提取量為0.416 1 mg/g，低于理論預測值2.96%。表明該設計方法可用于蕎麥蘆丁超聲提取工藝的分析和預測，具有較高的可靠性。

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