牦牛PRDX5基因的克隆測序及其在牦牛與犏牛睪丸中的表達差異

唐會會+鄭玉才+王鵬非+金素鈺+黃林

摘要：測定牦?；蛐蛄?，并比較其在牦牛和雄性不育犏牛睪丸組織中的表達差異，以探究該基因與犏牛雄性不育的關系。從牦牛睪丸組織中提取總RNA，采用RT-PCR技術克隆并測序獲得牦?；虻腸DNA序列；利用實時熒光定量RT-PCR技術檢測該基因在牦牛與犏牛睪丸組織中的表達情況。結果表明：克隆獲得的牦牛Prdx5序列長759 bp，包含長660 bp的CDS區，該序列與普通?；蛳嗖?個堿基，序列同源性為99.47%，相差的4個核苷酸導致推導的氨基酸序列存在3個氨基酸殘基差異；[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛和犏牛睪丸組織中均有表達，在牦牛睪丸組織中的表達量極顯著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睪丸組織中表達量的6倍，提示Prdx5在犏牛睪丸組織中低水平表達可能與其雄性不育有關。

關鍵詞：牦牛；雜交雄性不育；[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因；基因表達；睪丸

中圖分類號： Q785；S823.8文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0053-04

過氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxin，PRDX）家族是過氧化物酶超家族成員[1]，廣泛分布于原核及真核生物體內[2-3]。該家族蛋白利用其N-端保守的Cys殘基催化還原細胞內活性氧（ROS），從而保護細胞免受內外界環境中氧化脅迫帶來的損害，是一類巰基依賴性抗氧化蛋白酶[3]。PRDX5別稱AOEB166、PMP20、AOPP，是哺乳動物Prx家族中唯一的非典型2-Cys Prx [4]，主要分布于細胞的線粒體、溶酶體、細胞質、細胞核中[5-8]。該酶不僅在免疫調控[9]、細胞凋亡[10]、信號通路調節[11]等方面發揮作用，其功能主要在于還原細胞內過量的ROS。過量的ROS會引起細胞及組織損傷，對動物精子細胞更易造成損害，使精子細胞膜脂質過氧化、DNA結構破壞、凋亡加速，最終導致哺乳動物雄性不育[12]。據估計，約1/4不育男性患者精液中ROS水平升高[13-14]。PRDX5能以高效的還原能力[15]保護精子免受氧化脅迫損害，因此Prdx5水平偏低可能與哺乳動物雄性不育有關。

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有牛種，其與普通牛（Bos taurus）的雜交后代（犏牛）表現出F1至F3代雄性不育，這極大限制了犏牛雜種優勢的固定，是牦牛雜交改良的一大難題。目前，有關犏牛雄性不育分子機制研究的相關基因如b-Boule[16]、[WTBX][STBX]Dmrt7[WTBZ][STBZ][17]、[WTBX][STBX]Sycp3[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]Fabp5、Fabp9[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]Piwil1[WTBZ][STBZ][20]、Bvh[21]、Ldhc[22]等，主要涉及精子減數分裂阻滯、能量代謝、DNA甲基化、轉錄調控等方面，但從睪丸過氧脅迫角度探究犏牛雄性不育的機制尚未見報道。對牦牛與犏牛睪丸組織蛋白質組學研究結果進行比較發現，牦牛睪丸PRDX5蛋白水平遠高于犏牛（約3.9倍），過低的PRDX5蛋白水平可能會使犏牛睪丸組織遭受ROS氧化脅迫，影響精子的正常發生。本研究通過基因克隆的方法獲得了牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的完整編碼區序列，并比較了牦牛與普通牛的基因序列及氨基酸序列；同時利用實時熒光定量PCR方法分析該基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的mRNA水平，以探索[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因表達水平與犏牛雄性不育的關聯。

1材料與方法

1.1材料

供試成年牦牛（n=9）及犏牛（n=7）的睪丸組織均于秋季采自四川省成都市青白江區屠宰場，采集后立即放入液氮速凍并送回實驗室。所有樣品均于-80 ℃保存備用。

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆測序

利用TRIzol試劑（Invitrogen公司）按照其產品操作說明從睪丸組織中提取總RNA。以牦?？俁NA為模板，以Oligo（dT）18為反轉錄引物，采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）進行反轉錄合成cDNA第1鏈。根據已公布普通牛的[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]核酸序列（GenBank登錄號：NM_174749），運用Primer Premier 5.0軟件在該序列的CDS區兩側設計PCR特異引物，即F：5′-TCCGCCCAGCCTTCTACCTC-3′；R：5′-GAAAGGGCCGGAGGAGGATAT-3′。以cDNA為模板，按照如下程序進行擴增：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。預期能擴增出包含[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因CDS區在內的759 bp的片段。PCR產物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。RT-PCR產物經E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit（OMEGA公司）純化后連接到pMD19-T載體（TaKaRa公司），再轉化至大腸桿菌DH5α宿主中進行克隆?？拱逼S重組篩選后挑選出20個陽性單克隆進行擴大培養，經菌液PCR鑒定后，將含有目的片段的單克隆雙向測序，測序引物為pUC系列載體通用引物M13F及M13R。

1.2.2牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的序列特征分析在NCBI數據庫中使用Blast工具將所測序列與野牦牛、普通牛的cDNA序列進行同源性比對，并在該數據庫中比對其編碼的氨基酸序列。使用蛋白質預測在線分析軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）對Prdx5編碼的氨基酸序列的二級結構進行預測。

1.2.3牦牛及犏牛睪丸中基因豐度檢測采用實時熒光定量PCR方法對牦牛及犏牛睪丸組織中的[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達水平進行檢測。根據克隆測序后的cDNA序列以及普通牛內參基因Gapdh、18S rRNA序列信息，采用Primer Premier 5.0軟件分別設計定量PCR特異引物（表1）。提取的總RNA經質量檢測合格后，取4 μg利用上述試劑盒自帶的隨機六聚體引物進行反轉錄，合成cDNA作[HJ1.4mm]為定量模板。PCR反應體系為：QuantiFastTM SYBR Green PCR Master mix（QIAGEN公司）12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積共25 μL。PCR程序為：[HJ]預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，引物退火（退火溫度詳見表1）20 s，72 ℃ 延伸15 s，共40個循環。定量PCR檢測分為牦牛組和犏牛組，組內每個樣品[JP3]同時檢測目的基因和2個內參基因，每個基因設3個平行重復。

1.2.4數據統計分析每個樣品的檢測結果利用2個內參基因CT值的幾何平均數對目的基因進行校正。牦牛和犏牛組間相對表達水平使用2-ΔΔCT法[23]進行計算；采用SPSS 13.0軟件對2組數據進行獨立樣本t檢驗分析，以α=0.05作為差異顯著標準。[FL）]

2結果與分析

2.1牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆測序

采用RT-PCR方法對牦牛睪丸組織中的基因進行擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條特異的與預期大小相一致的DNA片段（圖1）。該片段經克隆測序顯示其長度為759 bp，包含長660 bp的完整CDS區，與普通牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]序列比對證實該片段為牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因序列。相差4個堿基，其CDS區的227、231、433、476位堿基依次為A、A、G、A，普通牛則為G、G、A、G。4個堿基差異導致牦牛與普通牛氨基酸序列存在3處差異，即牦牛的76、145、159位氨基酸依次為Glu、Ala、Asn，普通牛則為Gly、Thr、Ser，氨基酸序列相似性為98.63%。

牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因推導的氨基酸序列含219個氨基酸殘基，是一個肽前體，其N-末端Met1至Met58區段為定位于線粒體的導肽，除導肽以外的肽段部分為成熟肽；成熟肽的C-末端還存在靶向進入過氧化物酶體的SQL信號序列[24]。Prdx5成熟肽段區共有3個Cys殘基，其中Cys47為該酶保守的催化殘基，Cys151為還原活性必需的非典型Cys殘基，2個活性Cys殘基周圍高度保守的特征序列分別為“PGAFTPGCSKTHLPGF”、“LNVEPDGTGLTCSLA”[24]（圖2）。件]序列及內參基因信息設計特異定量引物，定量PCR擴增獲得的溶解曲線峰形單一，表明特異性好。所建立的所有基因標準曲線顯示，擴增效率均落在 95%～105%范圍內，符合相應算法要求。定量結果分析表明，[WTBX]]基因在牦牛和犏牛睪丸組織中均有表達，在牦牛睪丸組織中的表達量極顯著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睪丸組織中表達量的6倍（圖3）。

3結論與討論

本研究成功克隆并獲得了牦牛睪丸組織基因的cDNA序列。牦牛[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]所編碼的氨基酸序列與普通牛相似性為98.63%，相差3個氨基酸殘基，但均不位于該酶的活性保守區內，表明該基因在進化上具有較高的保守性[2]。有差異的3個氨基酸殘基均位于成熟肽段內；從差異氨基酸極性上看，3個氨基酸中有2個在牦牛和普通牛中不變，僅145位氨基酸殘基在普通牛中為極性的Thr，而牦牛中為非極性的Ala。這種極性的差異是否導致空間結構的變化，最終影響該酶在牦牛中的功能尚需進一步研究。

哺乳動物精細胞中的ROS對于受精、染色質濃縮、細胞膜的重構、細胞內信號通路的激活、精子獲能、頂體反應是必不可少的[25]。哺乳動物精細胞膜由大量不飽和脂肪酸組成，且細胞質僅存有低濃度可抵抗ROS的酶，因此氧化脅迫極易導致脂質過氧化而首先破壞精子細胞膜。此外，過量的ROS會影響精子運動，損壞DNA結構，加速精細胞凋亡，引起精子數目減少、活力降低、功能損傷，最終導致雄性不育或胚胎發育異常[12]。Leyens等研究了[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在普通牛的腦、心、腎、睪丸等22個組織中的表達情況，結果表明[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在睪丸組織中的表達量最高，且遠遠高于其他組織[24]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的高表達可能與牛的繁育功能密切相關。本研究實時熒光定量PCR結果分析顯示，[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛睪丸組織中的表達量是犏牛的6倍，這與筆者所在課題組前期蛋白質組學分析得到的結果相一致，即PRDX5蛋白在牦牛睪丸組織中的含量是犏牛的6倍。Knoops等通過比較PRDX5催化過氧化氫與有機過氧化物的速率，認為PRDX5能更高速特異地還原脂質過氧化物[4]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表達水平可能對精子細胞膜完整性及精子的存亡具有重要意義。PRDX5定位于精子的頭部和線粒體膜間隙，其表達水平對精子DNA的完整性及精子運動能力均產生影響[26]。此外，細胞中過量的過氧氮族（reactive nitrogen species，RNS）可使睪丸功能紊亂、促性腺激素分泌降低，從而對哺乳動物的生殖能力造成損害[27]。PRDX5作為一種過氧亞硝基還原酶，能高速催化還原過氧亞硝基[15，28]，保護睪丸組織內細胞免遭過氮脅迫。相對于牦牛而言，犏牛睪丸組織中[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]基因的低表達水平可能導致精子損傷凋亡[18]，從而使睪丸組織功能紊亂、激素水平改變以致雄性不育，[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表達水平可能與犏牛雄性不育有關。

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