禾谷類作物高效啟動子分析專用載體p14781pro—GUS的構建

蒲鵬+謝曉東+白子彧+郭雨+古同華+李明+王俊斌+孫守鈞+丁博

摘要：啟動子決定了基因的組織器官表達特異性及其在環境、內源激素作用下的誘導型表達，因此對啟動子的分析有利于解析基因的表達模式及功能。對玉米Ubiquitin啟動子控制的nptII抗性基因添加適宜的酶切位點，連接到pGWB433雙元載體中，構建目標表達載體p14781pro-GUS。該載體具有適于在禾谷類作物中篩選轉基因植株的Ubiquitin-nptII組件、啟動子高效克隆的Gateway組件，且整合進載體的啟動子可控制報告基因GUS的表達，以確定啟動子的轉錄調控模式，因而能夠更加深入便捷地研究禾谷類作物重要性狀相關基因的啟動子，推動針對重要性狀的分子遺傳改良。

關鍵詞：啟動子；載體構建；p14781pro-GUS；GUS蛋白；限制性內切酶

中圖分類號： Q782文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0060-03

目前，應用于雙子葉轉基因體系中啟動子分析的載體非常豐富，如pGWB系列載體，研究也已非常完備。而單子葉植物轉基因體系的研究盡管已取得很好進展，但適于單子葉特別是禾谷類作物啟動子研究的載體卻非常有限。

在植物表達載體中廣泛應用的啟動子是組成型啟動子，例如，絕大多數雙子葉轉基因植物均使用CaMV 35S啟動子，禾谷類轉基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動子[1]和來自水稻的Actin I啟動子[2]。在這些組成型表達啟動子的控制下，外源基因可在轉基因植物的所有部位和所有發育階段表達[3]。

Ubiquitin 啟動子是一個在禾谷類作物中有較強表達的啟動子，Ubiquitin啟動子來自玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），它實際上包括Ubiquitin基因的啟動子區、5′非翻譯區和第一內含子。研究表明，Ubiquitin啟動子在禾谷類作物中能組成型過量表達，表達效率高于35 S啟動子[4]。

GUS的基因gusA（又稱uidA）來自大腸桿菌菌株K12。Novel等研究并克隆了含有uidA基因的DNA片段，對其調控部分進行了分析[5-7]。Jefferson等進行了uidA基因的序列分析，該基因編碼區長1 809 bp，并由此發展了uidA基因作為一個基因融合標記，使其得到了更廣泛的應用[8]。該酶與5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽（X-Gluc）底物發生藍色沉淀反應，檢測容易、高效、方法多樣，且靈敏度高于GFP檢測[9]。GUS基因作為基因融合的標記，最初應用于大腸桿菌。后來發現幾乎所有的高等植物，特別是已研究的煙草、矮牽牛及擬南芥等，都很少或幾乎沒有GUS活性[10]，因此GUS基因被廣泛用作轉基因植物中的報告基因。

相對于傳統的使用限制性內切酶構建表達載體，由 Invitrogen 公司開發的Gateway克隆技術得到廣大研究者的認同和青睞。該技術基于K噬菌體位點特異性重組原理[11]，其優點在于可以在不同的克隆載體之間實現DNA 片段的轉移，并保持基因定位和閱讀框架不發生改變。對于研究者來說，這項技術是進行載體構建的入門技術，簡便易行。

本研究擬通過構建表達載體p14781pro-GUS，建立適用于禾谷類作物高效啟動子功能分析的載體系統和評價體系。應用本載體，可通過Gateway克隆技術高效克隆目標啟動子序列，由于Ubiquitin啟動子和nptII抗性基因的結合，易于對禾谷類作物轉基因株系進行篩選鑒定。此外，利用GUS報告基因的表達水平來衡量啟動子的功能，也方便了啟動子功能的鑒定。對禾谷類作物重要性狀相關基因進行啟動子研究，對推動針對重要性狀的分子遺傳改良有重要的理論和應用意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

質粒pGWB433、pEASY-ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]均為筆者實驗室保存，ubi代表Ubiquitin啟動子序列，npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]代表新霉素磷酸轉移酶基因（Neomycin Phosphotransferase Ⅱ，NPTⅡ）。

大腸桿菌菌株（E.coli）DH5α、DB3.1感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2試劑和生物學軟件

Phusion超保真DNA聚合酶和限制性內切酶購自New England Biolabs公司，pGEM-T Easy 載體購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取試劑盒和特異性引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，生物信息學研究所用軟件為Geneious 8、Vector NTI Advanced 11。

進行TA克隆反應，將回收產物連接到載體pGEM-T easy上，熱激轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。挑取陽性克隆，搖菌培養，用質粒提取試劑盒收集質粒pGUN。

1.3.2ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]片段與pGWB433載體的組裝將pGWB433和pGUN進行雙酶切反應。酶切先用SacⅡ在37 ℃反應30 min，再加入1 μL AscI 37 ℃反應40 min，電泳檢測。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，產物通過T4 DNA連接酶連接，連接體系于25 ℃反應1 h后，轉化大腸桿菌DB3.1感受態細胞。菌落PCR驗證轉化反應產物，挑取驗證正確的克隆進行測序（北京六合華大基因科技股份有限公司），具體的載體構建思路見圖1。

2結果與分析

2.1pGUN載體的構建

為了進行雙酶切反應，首先設計合成了包含AscⅠ、SacⅡ位點的1對引物，得到了pGUN載體。

2.2p14781pro-GUS載體構建

AscI對質粒pGWB433和pGUN進行單酶切，SacII對酶切之后的片段再次酶切，結果見圖2。取SacII/AscI酶切回收后的片段，按照大約1 ∶[KG-*3]1的分子比在T4 DNA連接酶催化下進行定向重組，菌落PCR結果見圖3。把菌落PCR篩選出的質粒進行測序，做進一步驗證，測序結果正確（測序圖未顯示），p14781pro-GUS載體見圖4。

3討論

啟動子決定了基因的表達模式，包括在組織器官的表達特異性和在誘導物作用下的誘導型表達，因此對啟動子功能分析有利于解析基因的生物學功能。外源基因在受體植物內持續、高效地表達不但造成能量浪費，往往還會引起植物的形態和生長發育的改變。為了使外源基因在植物體內有效發揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，目前人們對誘導型及特異表達型啟動子的研究和應用越來越重視，而作物與糧食安全和人類生活質量密切相關，對禾谷類作物啟動子的研究與特異性啟動子的篩選越來越重要。

本研究選用Ubiquitin啟動子調控抗性基因的表達，與已有的表達載體多采用CaMV 35S啟動子相比，抗性基因的表達水平可明顯提高[4]，對于遺傳轉化效率普遍較低的禾谷類作物，能更有效地篩選出陽性植株，輔助PCR進行篩選陽性植株會提高篩選效率[12]。

該載體對啟動子分析的元件為gusA基因，與此前筆者實驗室構建的pUKGF載體同為研究禾谷類作物啟動子功能的表達載體[13]。在應用中將2個載體進行比較可知：pUKGF可對活體植物進行連續活體觀察，觀測手段簡單，但對具有自發熒光的組織就無法準確進行此類分析。Jordan觀測到在1株轉基因小麥的不同胚中GFP強度有明顯差異[14]；p14781pro-GUS則需要經過X-Gluc組織化學染色，步驟較熒光觀測繁瑣，且為破壞性試驗，植物不可繼續生長發育，但對GUS酶的放大作用與植物自身無GUS活性，檢測效果靈敏，肉眼即可觀測結果，因此應用范圍更廣泛[9]。在觀測根系等組織特異表達的啟動子效率時可采用p14781pro-GUS載體。筆者所在研究組已經成功采取GUS染色評價表達載體pKIGW在擬南芥中的應用效果[15]。

近年來，農桿菌介導轉化禾谷類作物的成功，為進行基因功能分析奠定了基礎[16-17]。本研究中構建的pUKGS載體可以利用Gateway技術克隆目的片段，分析啟動子功能的載體的核心元件為attR1-Cmr-ccdB-attR2-tag-terminator，該表達載體即可用于下游植物遺傳工程中的“后基因組研究”[18]，大大提高了克隆效率，可作為禾谷類作物遺傳轉化中的首選。

該載體系統所選擇的質粒重組技術、報告基因、抗性標記基因，均是目前國際、國內植物轉基因領域應用最多的元件，尤其是由Ubiquitin啟動子調控抗性標記基因，能在禾谷類作物的陽性植株篩選上發揮獨特作用。

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