蘿卜抽薹相關SRAP分子標記篩選與分析

劉哲+許園園+蘇小俊

摘要：利用抽薹性狀差異較大的晚抽薹蘿卜品種L2和早抽薹蘿卜品種E6配制雜交組合，構建F2群體。通過田間調查，選用極晚和極早抽薹單株分別構建晚抽池（BSA-1）和早抽池（BSA-2），用288對SRAP組合對兩親本進行PCR分析，共篩選出166對SRAP引物組合。通過2個基因池及基因池中各單株對篩選出的引物進行復篩，獲得引物組合me3+em9，其在晚抽池中可擴增出多態性片段LB；對156株F2單株進行驗證發現，LB與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM。

關鍵詞：蘿卜；晚抽薹；分子標記；遺傳距離

中圖分類號： Q943；S631.103文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0074-03

抽薹開花是農業生產上的一個重要現象，不僅對植物生殖器官的形成起關鍵作用，而且關乎到植物的生物產量和產品品質。先期抽薹在十字花科作物栽培上是一個倍受關注的問題，不僅會降低十字花科作物的生物產量，而且會影響到產品的品質，晚抽薹是十字花科作物一個重要的育種目標[1]。生物技術的發展給作物遺傳育種研究帶來巨大變化，分子標記技術的應用是其中之一。分子標記具有位點豐富、多態性高、穩定可靠等特點，且檢測不受時間和性狀表達限制，可鑒別基因型的純合或雜合。本研究利用與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標記可以方便準確識別不同晚抽薹基因的特點，通過群體分離分析法（BSA）篩選出與晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的分子標記，以實現分子標記輔助育種，減少蘿卜選育過程中對表型性狀的依賴，從而大大提高蘿卜的育種效率。

1材料與方法

1.1材料

蘿卜晚抽薹品種L2，為韓國白玉春蘿卜第9代自交系；早抽薹品種E6，為短葉13蘿卜第10代自交系，均由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。將晚抽薹與早抽薹親本進行雜交再自交，形成F2分離世代群體共計156株單株。引物由上海英俊進行合成；dNTPs、TaqDNA聚合酶等分子生物學試劑，均購于TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取與檢測試驗于2014年在江蘇省農業科學院園藝研究所高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行，基因組DNA提取采用改良的CTAB法。采用DYY-Ⅲ-5型穩壓穩流電泳儀，緩沖液為1.2%TAE，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時電壓100 V（5 V/cm），時間為1 h。電泳結束，在 FR-200 紫外可見分析裝置上檢測、照相，記錄結果。

1.2.2SRAP反應采用優化的SRAP反應體系，SRAP引物序列參考Li等信息[2-3]。PCR反應體系（10 μL）為：3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L上、下游引物，0.6 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA。PCR反應程序為94 ℃變性3 min；94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，5個循環；94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，33個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V預電泳30 min，160 V電泳2.5 h。凝膠中含有Arc ∶[KG-*3]Bis為29 ∶[KG-*3]1 6.65 mL，5×TBE 5 mL，TEMED 20 μL，10%AP 0.3 mL。1×TBE電泳緩沖液配方（1 L）為：0.054 g Tris，0027 5 g硼酸，0.25 mol/L EDTA 0.04 mL，pH值為8.0。電泳結束，采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定15～20 min，0.2% AgNO3溶液染色12～15 min；蒸餾水洗滌2次，于含1.5%NaOH、0.4%甲醛、0.002% Na2S2O3的顯影液中顯影，白熾燈箱下觀察拍照。

1.2.3引物篩選利用蘿卜晚抽薹品種代號L2和早抽薹品種E6的DNA為模板，從現有288對SRAP引物中篩選出雙親間存在多態性、條帶清楚、易于識別、可以穩定擴增的引物；基于抽薹性狀表現型，在F2群體中選取極早抽薹和極晚抽薹單株各10株，構建早抽池（BSA-1）及晚抽池（BSA-2），待幼苗長至5葉1心時提取DNA，等量混合；分別提取各單株基因組DNA，以早抽池、晚抽池及2個基因池中各單株 DNA 為模板，對篩選出的多態性引物進行再次篩選，尋找可能與目標基因連鎖的標記；用獲得的DNA標記對F2群體進行標記。PCR 產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。

1.3數據統計及連鎖分析

用篩選到的具有多態性引物組合對待檢測F2群體的DNA樣品進行PCR擴增，統計有差異、易于識別的多態性條帶，有帶記為1，無帶記為0。田間調查時，分別以1、0記錄晚抽薹、早抽薹的植株；根據引物擴增結果，建立SRAP數據庫；使用Joinmap 4.0分析分子標記，設最小LOD值為3.0，并用Kosambi函數將重組值轉換成圖距單位（cM）。

2結果與分析

[FL（2K2]em9進一步驗證，各標記在分離群體中并非表現為全有和全無的差別，有少數晚抽薹蘿卜單株未能擴增出差異條帶，同樣也有少數早抽薹單株擴增產生差異條帶。用Joinmap 4.0軟件對分子標記進行分析得知，me3+em9與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7 cM（圖4）。

3結論與討論

分子標記技術與其他分子生物學研究相比，具有簡單快捷的優點。相關序列擴增多態性（SRAP）是Li等[2]發展的一種分子標記方法，具有簡便、產率高、可顯示大量的共顯性標記、易從序列中得到分離條帶等優點，已被廣泛應用于圖譜構建、比較基因組學、基因克隆和遺傳多樣性等研究[4-9]。Li等在對羽衣甘藍×花椰菜的RI系構建遺傳圖譜時，用SRAP成功標記了芥子油脫飽和基因BoGLSALK，該基因在圖譜Ll連鎖群上距SRAPl33標記為1.4 cM[7]。另外，研究人員在中國白菜中發現了1個與雄性不育基因有關的SRAP標記，在油菜中篩選到1個與恢復基因連鎖的SRAP標記，在芹菜中獲得1個與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標記[10]。

抽薹性狀屬于數量性狀遺傳，易受環境條件的限制影響。目前，利用分子標記技術對抽薹性狀的研究已有諸多報道。Ken等通過甘藍和青花菜的F2群體RFLP連鎖圖，鑒定出控制從種植至現蕾天數的主效基因位于第2、第7連鎖群上，從種植到現蕾的天數、現蕾到開花的天數這2個性狀的許多標記位點密切相關。曹維榮等運用RAPD技術，采用混合分離群體法（BSA）對甘藍遲抽蔓基因相連鎖的分子標記進行研究，得到與甘藍遲抽蔓基因相連鎖的RAPD標記Nl-750，其連鎖距離為7.9 cM[11]。卓祖闖等運用RAPD、SRAP、RSAP、SSR、SCAR技術，采用BSA法對大白菜晚抽蔓基因緊密連鎖的分子標記進行研究，分別獲得1個晚抽蔓基因緊密連鎖的RAPD標記和RSAP標記，同時獲得1個與早抽蔓基因連鎖的SRAP標記[12]。

本研究中，從288對引物中篩選獲得116對可以在雙親間穩定擴增出清晰條帶、表現出多態性的引物組合，多態率為40.3%；將116對引物的PCR產物用8%非變性聚丙烯凝膠酰胺電泳構建圖譜，共得到條帶285條，其中多態性條帶為66條，多態率為23.2%，每對引物擴增出的條帶數量范圍為0～40，多態性條帶的數量范圍為0～5，得到與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標記1個，其遺傳距離為5.7 cM。這為以后的蘿卜晚抽薹育種提供了理論基礎。

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