勿忘我組培快繁技術的優化

曹君邁+彭亞齊+唐世明+陳淑媛+王彤彤+陳星

摘要：以藍色勿忘我種子為材料，發芽后取其幼苗莖尖、葉片和下胚軸為外植體，進行勿忘我組培快繁技術的優化試驗。通過研究外植體、接種方式、培養基配方、光質對勿忘我不定芽形成、增殖、生根的影響，優化篩選出適宜勿忘我組培的最佳外植體為莖尖，其誘導率最高達69.32%，其次為子葉，其誘導率為18.06%；適宜莖尖誘導分化的培養基為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導率最高達83.33%；適宜子葉誘導分化的培養基為 MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導率最高達20.83%；適宜增殖培養的培養基為1/2MS（不加肌醇，將維生素B1提高到1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，增殖系數為16.5；適宜生根的培養基為1/2MS+0.4 mg/L NAA，采用溫差培養法，生根率提高到90%。適宜勿忘我增殖培養的光質為紅光，之后轉入白光進行培養。本試驗的結果可為勿忘我組培快繁技術的應用提供一定的技術支撐。

關鍵詞：勿忘我；外植體；增殖；生根；光質

中圖分類號： S682.390.4+3文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0077-04

勿忘我（Limonium sinuatum）屬補血草屬植物，全世界植物資源有300種，我國有十七八種[1]，主要分布于西北、東北和華北，即新疆、甘肅、內蒙古和寧夏等省。補血草屬多為耐鹽抗旱的旱生植物，是我國優良的野生植物資源，具有很高的觀賞價值、極高的藥用價值；而其花多、花期長、泌蜜豐富，是重要的夏秋季蜜源植物；由于其耐鹽、抗寒、抗旱性強、節水顯著等特性，在防風固沙、生態恢復中具有重要的應用價值[2]。隨著人們對環境美化的需求和保健意識的增強，市場需求量快速發展，利用組培快繁技術，提高組培苗的增殖率及有效苗的數量和質量，解決市場需求，達到資源利用和保護的協調發展。

勿忘我是補血草中的一種，它具有大量的不孕枝和同型雜交不孕的特點，種子結實少，限制了它的規?；a的發展[3]，此外，成本過高也是影響規?；?、產業化生產的又一因素。有關勿忘我組織培養國內外已有許多報道[4-9]，近年來勿忘我采用組培快繁技術，不僅繁殖系數高，還可有效去除病毒，以確保遺傳性狀的穩定性和切花質量的改善。在勿忘我組培快繁的研究中，有許多關于誘導[10]、增殖[11]、生根及煉苗[12-13]的研究報道，通過大量試驗，究者們已經篩選出一些適宜的培養基配方及培養條件。在兼顧增殖率與組培苗質量的前提下，正在努力使勿忘我組培苗快速產業化，以滿足市場的需求。本試驗在確保組培苗增殖率和質量的前提下，以降低成本和加快繁殖速度為目標，研究組培快繁過程中各環節的關鍵影響因子，建立高效實用的勿忘我組培快繁技術體系，以期為產業化開發提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

藍色勿忘我種子網購于浙江永康無市花之谷貿易有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1培養基配方試驗培養基配方詳見表1。

1.2.2光質條件試驗光質條件詳見表2。

1.2.3試驗設計方法在誘導分化培養、增殖培養和生根培養階段，針對各階段的特點，分別對外植體、培養基配方采用單因素隨機區組設計；在增殖培養條件的篩選中，采用單因素設計研究7種光質因子的影響。每個處理接種8瓶，每瓶內接入4個外植體。在試驗過程中，對出愈率、誘導分化率、玻璃化率、增殖系數、生根率、葉片數、葉綠素含量等指標進行統計，記載時隨機抽取2瓶，求其平均值作為1次重復，共重復3次，并對試驗結果采用單因素統計學方法分析。

1.2.4材料的處理采用陳淑媛等的方法[6]進行。

1.2.5種子的萌發將消毒滅菌后的種子接種到MS+3%蔗糖+7%瓊脂培養基上后，放置于黑暗處，（25±2） ℃溫度下，待發芽長出具有2張子葉的幼苗后置于光照下培養，子葉變綠后進行起始培養。統計每瓶MS培養基內接入的種子數和發芽種子數，計算其發芽率。

1.2.6誘導分化培養在超凈工作臺上，按無菌操作技術要求分別切取勿忘我的下胚軸（長0.5 cm）、莖尖（長0.5～1.0 cm）、子葉作為外植體，3種外植體均接種到起始培養基A1～A5號上。下胚軸與莖尖的形態學下端插入培養基；子葉均勻劃3刀，分正反（光照面朝上為正放，朝下為反放）接種于培養基內。

1.2.7增殖培養在超凈工作臺上，按無菌操作技術要求，切取同一種培養基中長勢相似的勿忘我帶芽幼苗莖尖（長 0.5～1.0 cm） 為外植體， 接種于增殖培養基B1～B5號上進

1.2.8生根培養在超凈工作臺上，按無菌操作技術要求，取同一種培養基中大小相似、具3～5張葉的、高大于2.0 cm的無根苗，分成單株接種于生根培養基C1～C5號中，采用變溫培養法培養。

1.2.9光質對勿忘我組培苗增殖的影響在超凈工作臺上，按無菌操作技術要求，切取同一種培養基中長勢相似的勿忘我帶芽幼苗莖尖（長0.5～1.0 cm）為外植體，接種于增殖培養基B2號（MS+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT）上進行叢生芽誘導的培養。

1.2.10葉綠素含量的測定離體法萃取葉綠素及分光光度計法測定步驟：取適量新鮮葉片→吸水紙擦干凈→去主脈→剪成小于1 mm2的小塊，混勻→稱取0.2 g至研缽中→加入 5 mL 95%乙醇、少量碳酸鈣粉末，研磨至葉片組織變白→靜置3～5 min→過濾至燒杯中→定容至25 mL容量瓶中→652 nm 下測D值，95%乙醇調零。

葉綠素總含量（mg/g）=（D652 nm×V）/（34.5×m）。

式中：V為提取液總量，mL，如果比色前進行稀釋，則應乘以稀釋倍數；m為稱取葉片質量，g。

1.3培養條件

誘導分化培養、增殖培養置于PGX-1000B型光照培養箱中暗培養，溫度為（25±2） ℃。5 d后，設置光照度為 2 500 lx，光照時間為12 h/d，溫度為（25±2） ℃進行光照培養。生根培養置于光照培養箱中，光照度為2 500 lx，光照時間為12 h/d，光照下溫度為（28±2） ℃，黑暗下溫度為（22±2） ℃。光質試驗置于7種不同光質處理下培養，光照度為 2 500 lx，光照時間為12 h/d，溫度為（25±2） ℃。

1.4指標記錄

7 d后，每天觀察記錄每種培養基內組培苗的生長狀況，30 d后調查其愈傷組織數、玻璃化苗數和正常小苗數、增殖芽數、生根數。

在光質試驗中，于30 d后調查其增殖數、葉片數、莖長，測定葉綠素的含量，計算其增殖系數、平均葉片數、平均莖長、葉綠素含量。

2結果與分析

2.1種子萌發的調查

接入種子總數為199粒，發芽總數為128粒，發芽率為64.32%。勿忘我種子滅菌后影響了發芽率，可適當縮短 NaClO 滅菌的時間。

2.2誘導分化培養的研究

2.2.1外植體對不定芽形成的影響從表3可以看出，不同外植體間，不定芽的形成存在顯著差異，莖尖的出愈率、玻璃化率和誘導分化率均顯著高于子葉和下胚軸；子葉顯著高于下胚軸。由此可見，外植體誘導不定芽能力從大到小為莖尖>子葉>下胚軸。

2.2.2不同培養基配方對莖尖不定芽誘導的影響接種后莖尖下端開始膨大，繼而出現淺綠色顆粒狀突起， 約3周后，2.2.3不同培養基配方對子葉不定芽誘導的影響子葉接種到培養基上后，傷口處膨大形成愈傷組織，形成少量不定芽。對表5數據進行統計學分析，培養基間對莖尖的出愈率、玻璃化率、誘導率的影響達到顯著水平。其中，A5的出愈率顯著高于A1、A2、A3和A4；A1、A2的出愈率顯著高于A3、A4。A4的玻璃化率顯著低于A1、A2、A3和A5；A3的玻璃化率顯著低于A1、A2和A5；A1、A2的玻璃化率顯著低于A5。A5的誘導率顯著高于A1、A2、A3和A4；A2、A3的誘導率顯著高于A1和A4；A1的誘導率顯著高于A4。A5培養基的出愈率和誘導率雖然在所有培養基中最高，但其玻璃化率也最高，對后期的繁殖生長不利。綜合考慮，A2培養基的效果最好，出愈率和誘導率適中，玻璃化率低。所以在子葉不定芽的誘導中，篩選的最佳誘導分化培養基為A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

2.2.5不同培養基配方對下胚軸不定芽誘導的影響下胚軸在不定芽誘導過程中，雖然下端膨大，但沒有產生愈傷組織，隨著時間的推移發生褐化而死，最終僅有極少數不定芽產生。通過對表7數據進行統計學分析得出，不同培養基配方對下胚軸不定芽誘導的影響顯著。5個處理間的出愈率、玻璃化率差異不顯著，而誘導率差異顯著。A1、A5的誘導率顯著高于A3、A4；A1、A2、A5之間的誘導率差異不顯著；A2、A3、A4之間的誘導率差異不顯著。綜合來看，A2的誘導率適中，而其成本低于A3、A4培養基，所以篩選的最佳誘導分化培養基為A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

3結論與討論

3.1討論

本試驗是在實驗室前期研究的基礎上[6]，針對試驗方法和培養條件進一步深入研究探索，優化勿忘我組培快繁技術條件。前期研究中只采用莖尖誘導分化，而本次試驗在誘導分化培養階段也利用子葉和下胚軸進行不定芽的誘導，這增加了快繁誘導途徑。結果表明，莖尖為誘導分化培養的最優外植體，這與王淑敏的試驗結果[12]相符，但其誘導分化培養成分相同，但6-BA激素用量降低了0.1 mg/L。

本試驗在研究子葉誘導不定芽過程中，研究正面反面放置2種接種方式對子葉不定芽誘導的影響，這是前人還沒有研究過的。

本試驗在增殖階段對培養基進行改良，篩選出的最優增殖培養基大量元素減半、不加肌醇，且將維生素B1提高到 1 mg/L，增殖系數較陳淑媛等的[6]高，這與朱至清的研究結果[14]相吻合。與馮曉英的增殖培養研究[15]比，篩選的增殖培養基減少了營養成分，降低了生產成本，有利于組培工廠化生產的節體增效。

而在生根培養階段，使用的生根培養基與陳淑媛等的[6]一樣，但是利用溫差培養法生根率提高了10%。這可能是因為在變溫培養中，白天積累有機物，晚上減少有機物的消耗，使得勿忘我組培苗的有機物得以積累得更多，從而根粗苗壯。因此，可以在勿忘我組培快繁生根過程中將恒溫培養法改為變溫培養法。

在組織培養的微環境中，光是一個重要的因素，前人已經研究了光照時間、光照度對勿忘我組培苗生長的影響[16]。而光質對勿忘我增殖的影響目前還沒有人研究，本試驗中紅光有利于勿忘我組培苗的增殖，再轉入白光下培養進行壯苗，更有利于組培苗的生長。

而組培過程中的三大問題之一的玻璃苗，在本試驗中也有出現。今后可以在預防和解決玻璃苗出現這一方面加大研究，以提高勿忘我組培苗的質量，為勿忘我的組培工廠化生產增產增效。

3.2結論

不定芽誘導過程中，外植體的篩選至關重要。勿忘我出芽情況以莖尖誘導率最高，而下胚軸和子葉則只能誘導少量不定芽。其誘導不定芽能力從大到小為莖尖>子葉>下胚軸。因此，誘導不定芽最佳的外植體為莖尖。

勿忘我莖尖不定芽的誘導培養階段，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為 5.8～6.0條件下，篩選出的最佳誘導分化培養基為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我子葉誘導不定芽的培養中，子葉正面放置有利于誘導不定芽，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為5.8～6.0條件下，篩選的最佳誘導分化培養基為MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我組培苗增殖過程中，以莖尖為外植體，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為5.8～6.0條件下，篩選出的最佳增殖培養基為1/2MS（不加肌醇，將維生素B1提高到 1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。在蔗糖 15 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為 5.8～6.0、變溫培養條件下，篩選的最佳生根培養基為1/2 MS+0.4 mg/L NAA。

適宜勿忘我增殖培養的光質條件為紅光。因此，可以先將勿忘我組培苗置于紅光條件下進行增殖培養，之后再轉入白光條件下進行正常培養，促進壯苗，且能提高勿忘我組培苗的增殖系數。

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