香水百合組織培養和快速繁殖條件的優化

方中明??+于恒??+白根祥??黃瑋婷??+曾宋君

摘要：以香水百合無菌試管苗小鱗莖作為外植體，從外植物體創傷、基本培養基、植物生長調節劑的配比以及培養基的物理狀態等幾個方面研究了百合鱗莖增殖的最優條件，并對百合組培苗的生根條件進行了優化。結果表明，一定的外植體創傷處理、氮元素含量較高的基本培養基和合適的植物生長調節劑濃度組合有利于鱗莖的增殖，香水百合鱗莖最佳增殖培養基配方為N6+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養基中，液體培養的鱗莖增殖倍數極顯著高于固體培養；香水百合小苗的最佳生根培養基配方為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

關鍵詞：百合；增殖；創傷；液體培養；培養條件；植物生長調節劑

中圖分類號： 682.2+90.4+3文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0081-05

百合（Lilium spp.）是指百合科百合屬多年生球根花卉，其花色鮮艷、花姿雅致，具有較高的觀賞價值和藥用價值。香水百合是百合中的“女王”，因其花大、芳香宜人、清雅脫俗而深受歡迎，主要做切花觀賞制成花束和花籃[1]。目前，中國香水百合的種球主要依賴進口，百合新品種的選育和商品種球的供應已成為制約我國百合產業發展的“瓶頸”問題，實現優質百合種球的國產化具有重要的現實意義，而國內的種苗繁殖方法以分球繁殖為主，有時也采用鱗片扦插，但以小鱗莖分株法及鱗片扦插法繁殖，繁殖率低，且長期的營養繁殖易使其感染病毒而降低花的質量，應用組培方法實現百合工業化生產是解決這一問題的有效途徑。目前，我國學者對香水百合的組織培養進行了相關研究，但主要集中以鱗片、葉片、花器官等為外植體的固體培養基誘導再生植株上[2-9]。本研究以香水百合無菌試管苗鱗莖為外植體，探討外植體創傷、基本培養基、植物生長調節劑的配比以及培養基的物理狀態探究對小鱗莖增殖的影響，篩選出最適宜培養基配方、培養方式以及生根培養基配方，以期為香水百合組培苗的工廠化大生產提供依據。

1材料與方法

1.1材料

香水百合無菌試管苗由武漢生物工程學院細胞工程實驗室提供。

1.2方法

1.2.1創傷處理對百合小鱗莖增殖的影響

選用大小相似、長勢較好的無性系香水百合小鱗莖作為本試驗的外植體材料，切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊。1組對小塊做切割處理（平行切割3刀），1組不進行任何處理作為對照，接種到 MS+20 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂的培養基中，pH值5.8，每瓶接 8個小鱗莖，共接30瓶。

培養條件為先暗培養15 d，然后放到光下培養。培養30 d 后，統計肉眼可以區分的香水百合小鱗莖個數，計算小鱗莖增殖系數（Q）=統計的小鱗莖個數/接種個數。

1.2.2不同增殖培養對百合小鱗莖增殖的影響

將無菌試管小苗切除葉片及根部，接種到15種不同增殖培養基中（表1），每瓶接種8個小鱗莖，共接30瓶。50 d后統計并計算能增殖的小鱗莖百分率、增殖系數和增加的質量。能增殖的小鱗莖百分率=分化的外植體數/接種的外植體數×100%。增殖率=增殖出的小鱗莖數/接種的小鱗莖數×100%。

1.2.3培養基不同物理狀態對百合小鱗莖增殖的影響以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8為基本培養基，分裝在50 mL的錐形瓶中，每瓶分裝20 mL；液體培養基中不加瓊脂但是加入定量的脫脂棉；液體培養基分裝在250 mL的錐形瓶中，每瓶分裝100 mL，并且加入0.3 g脫脂棉，滅菌備用。

選用大小相近長勢較好的香水百合小鱗莖，將外植體切割成大小為0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種到培養基上，每瓶均接種4個，共30瓶。搖床轉速：100 r/min。培養30 d后，統計香水百合小鱗莖個數，計算小鱗莖增殖系數。

1.2.4香水百合小苗生根

將增殖培養得到的香水百合鱗莖接種于壯苗培養基上培養，百合鱗莖壯苗培養基的配方為MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8。將經過壯苗培養獲得的生長健壯的百合小苗，接種到不同生長調節劑濃度的生根培養基上培養（表2）。每瓶接種6棵小苗，共接8瓶，30 d后統計在各個培養基上的生根情況，包括生根小苗數量、生根數、根長及生根率。生根率=生根外植體數/接種的外植體數×100%。

1.2.5培養條件和數據分析

以上培養基除特別說明外，其余的均加入3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8。培養條件：培養溫度為25 ℃，光照度為1 500 lx，每天光照12 h。數據分析采用SPSS軟件進行變量分析（ANOVA），以Duncans在005水平上進行顯著性差異分析。

2結果與分析

2.1創傷處理對香水百合鱗莖增殖的影響

經過創傷處理的百合鱗莖的增殖倍數可達到4.40，而未經創傷處理的對照僅為1.33，增殖倍數之間存在極顯著性差異（表3）。

2.2不同基本培養基對香水百合鱗莖增殖的影響

從圖1可以看出，不同基本培養基及生長調節劑濃度配比組合的培養基對百合能增殖小鱗莖的百分率具有重要的影響?？傮w上看，A組的鱗莖分化率低于B組、C組，而B組、C組之間差異不大。表明1/2MS、N6基本培養基較MS基本培養基更適合于香水百合鱗莖的分化增殖。在所有培養基中A5的百分率最低，除與A1、A3、A4和B4外的其他所有培養基均具有顯著性差異。C組能增殖小鱗莖的百分率均達到較高的水平，B3組能增殖小鱗莖達到93.75%，而A組均在71%以下。C組所用的基本培養基為N6培養基，說明在此培養基下，鱗莖的分化率穩定且處于較高水平。

從圖2可以看出，不同基本培養基及生長調節劑濃度配比組合培養基對百合小鱗莖增殖率也具有重要的影響。C組鱗莖的增殖系數總體要好于A組、B組，特別是C4組的增殖系數達到8.0。相比較而言，B組鱗莖的增殖系數總體要高于A組，特別是A1、A3這2種培養基的增殖率顯著低于其他培養基。在總質量的增加方面，C組的總質量普遍明顯高于A組、B組。因此，C組培養基特別是C4最適合于香水百合鱗莖的增殖及增質量（圖3）。

從圖1可以看出，A組中能增殖小鱗莖的百分率較高的是A1、A2、A3，說明在以基本培養基為MS基本培養基的條件下，低濃度的6-BA有助于鱗莖的啟動增殖；B組中能增殖小鱗莖的百分率最高的是B3，即6-BA濃度為1.5 mg/L時，而在6-BA濃度為2.0 mg/L時能增殖小鱗莖的百分率較低；C組中鱗莖的能增殖小鱗莖的百分率較穩定且處于較高水平，說明在基本培養基為N6培養基的條件下，6-BA濃度對鱗莖分化率的影響不大。

從圖2可以看出，在A、B、C這3組中，鱗莖增殖系數最高的是C3，而且其增殖系數遠高于其他組。表明在基本培養基為N6、6-BA濃度為2.0 mg/L時，最有利于香水百合鱗莖的增殖。從圖3可以看出，在A組中，高濃度的6-BA有利于鱗莖的增質量；而在B組、C組中，6-BA濃度對鱗莖的增質量沒有明顯的影響。

從鱗莖的生長狀況（圖4、圖5、圖6）上看，A1、B1、C1的鱗莖苗的生長高度均要好于A、B、C組中的其他處理，說明當生長調節劑配比為0.2 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA時有利于鱗莖苗的長高；各組中隨著6-BA濃度的增加，鱗莖苗越來越粗壯、嫩綠，[JP3]說明在一定范圍內，高濃度的6-BA有利于鱗莖苗的壯苗生長。

2.4不同物理狀態培養基對百合小鱗莖增殖倍數的影響

從表4可以看出，在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂培養基下，經液體搖床培養的百合鱗莖的增殖效果顯著優于固體培養，其平均增殖系數可達9.00。

2.5不同生長調節劑濃度配比對香水百合小苗生根的影響

3討論

3.1創傷處理對百合鱗莖增殖的影響

植物細胞在離體條件下仍具有發育為完整植株的潛能；只要外界環境對外植體刺激得當，激素添加比例適中，就能將植物細胞進行定向誘導[10]。本研究對百合鱗莖的創傷處理能使其增殖系數極顯著升高，原因可能是適當進行創傷處理對離體條件下的外植體產生了一定的刺激，同時，創傷產生的傷口有利于外植體對營養物質的快速吸收，促進了百合鱗莖的增殖，黃磊等在蝴蝶蘭葉片有組織培養中也獲得了相似的結果[11]。

3.2基本培養基對百合鱗莖增殖的影響

在百合的組織培養中對基本培養基的研究報道很少。本研究結果表明，在百合組織培養中普遍采用的MS培養基并不是香水百合增殖的適宜培養基，而N6培養基比較適宜香水百合的鱗莖增殖，與徐凌飛的研究結果[12]相似，可能是與N6培養基中較高的氮元素含量相關。張潔等的研究也表明，高濃度的大量元素有利于鱗莖的膨大，但不利于鱗莖的誘導[13]。施用氮肥可顯著提高花徑、葉面積、葉片數和瓶插壽命，表明氮素對香水百合切花品質有較為重要的影響[14]。適宜高濃度氮營養對百合生長有利[15-17]。

3.3生長調節劑對百合鱗莖增殖的影響

應用組織培養技術可以對香水百合進行快速繁殖，實現種球規?；苣晟a，莖芽增殖是擴繁的關鍵[18]。細胞分裂素與生長素的比例高有利于芽的誘導；細胞分裂素與生長素的比例低有利于根的誘導[10]。因而篩選適宜的激素濃度是增殖培養的關鍵。張惠華等認為，較高濃度的激素含量可以提高增殖倍數，但小鱗莖呈叢生狀態，愈傷化，因此在不同的生產階段，宜適當控制激素的濃度，在保證較高增殖倍數的同時保證種球的質量[19]。龐新霞等以6-BA、KT、NAA和IBA激素的不同組合培養基增殖東方百合發現，不同激素組合對東方百合的鱗莖組培芽的生長具有明顯的影響，相同的激素處理不同品種也存在差異[20]。藍炎陽等研究表明，細胞分裂素對組培中芽的增殖起主要作用，6-BA利于芽增殖，KT使組培苗更加健壯[21]。本試驗綜合香水百合鱗莖的增殖系數、增質量情況、生長情況，得出鱗莖增殖的最佳生長調節劑配比為0.2 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA。

3.4液體培養對百合鱗莖增殖的影響

液體培養是一種簡單高效的鱗莖生產方法，它可以極大地減少勞動量[22]。本研究采用液體培養基對香水百合小鱗莖進行增殖的誘導時發現，液體搖床培養的增殖效果極顯著優于固體培養，可能原因是在液體搖床培養基中的外植體與培養基有較大的接觸面積，有利于營養物質的吸收，從而加速鱗莖的增殖。

3.5植物生長調節劑對百合小苗生根的影響

影響百合鱗莖小苗生根的因素很多，但主要研究集中在基本培養基和植物生長調節劑2個方面。羅鳳霞等在新鐵炮百合研究中發現，不加任何激素的MS培養基為最佳生根培養基[23]。袁芳亭等認為，1/2MS并附加0.5～1.0 mg/L NAA的培養基效果較好[24]。袁雪等對2種培養基做了對比性研究，研究發現1/2MS培養基中的鱗莖苗生根率較高，達到了100%，但苗很纖弱；在MS培養基中，百合的生根率雖然較高，根系粗壯，但沒有側根發生，單苗根數較少，根長度也較小。在1/2MS培養基中添加適量吲哚丁酸（IBA）后，單苗根數明顯增多，根系更粗壯，但根系生長變慢，且側根發生減少[25]。本研究結果表明，在含有0.2 mg/LNAA的1/2MS培養基上添加一定濃度的IBA有利于香水百合的生根，特別是根數增加較多，獲得生根的最佳培養基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

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