5種植物粗提物對稻瘟病菌的抑菌活性

張翠榮??+李明??+李榮玉??

摘要：以稻瘟病菌為供試靶標，采用生長速率和孢子萌發測定法，對魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟的乙醇粗提物進行了抑菌活性測定。結果顯示，5種植物粗提液對稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時，馬尾松對該菌的菌絲生長及孢子萌發抑制率最高，分別為62.23%和65.54%，其EC50為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL，其次是姜和夾竹桃，其中魚腥草和香樟的抑菌活性相對較弱。

關鍵詞：稻瘟病菌；乙醇粗提物；抑菌活性

中圖分類號： S482.2+92；S435.111.4+1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0162-02

21世紀全球農業發展的一個重要趨勢是更加注重農產品質量安全，從天然植物中提取殺蟲殺菌活性物質防治病蟲害，已成為研究熱點，并對現代農藥研究具有重要意義。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有1/2的人口以稻米作為主食，其中水稻稻瘟病是危害水稻的三大病害之一[1-2]，它是由水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌性病害[3]。目前稻瘟病主要依靠化學防治，雖然化學防治具有效果顯著、廣譜性強、易推廣等優點，但在保障人類獲得豐厚農產品的同時，也給環境帶來了嚴重的污染[4-5]。

植物源殺菌劑是從某些植物的葉、花、莖、根、果實等部位分離提取的具有殺菌作用的活性物，植物殺蟲殺菌資源豐富，對環境、植物本身以及害蟲天敵均無影響，也不易使有害生物產生抗藥性，所以植物源殺菌劑成為目前農藥研究開發的熱點。例如大蒜中的大蒜素、蠶豆中的蠶豆酮等均可有效地抑制或殺死某些病原菌的生長發育[6-10]。植物通過長期進化而產生種類繁多的活性次生代謝物是植物抵御病原菌的重要武器，這些類型多樣的次生代謝物為開發新農藥提供了無限的研究資源。

國內對于防治水稻稻瘟病的植物源藥劑的開發也有初步研究，有研究表明山蒼子植物中含有對水稻稻瘟病菌毒殺作用的物質等。本研究探索5種植物（魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟）的乙醇粗提物對水稻稻瘟病的生物活性作用，以期為基于植物源藥劑防治水稻稻瘟病提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

供試植物均采摘于貴州大學農學院，植物名錄見表1。

1.2試驗方法

1.2.1植物的預處理及粗提物的制備將5種植物洗凈置于陰涼處晾干，然后放在恒溫干燥箱中以60 ℃的溫度烘干，小心取出植物分別放入研缽中充分研磨，直至成細粉末狀，將獲得干粉稱質量后置于密封瓶內保存備用。采用超聲波提取法進行粗提物的制備，提取溶劑為無水乙醇。

分別稱取5種植物干粉各10 g置于250 mL錐形瓶中，按照料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL加入無水乙醇中浸漬、振蕩、低溫靜置，真空抽濾、棄廢渣、減壓濃縮獲得浸膏狀植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解5種植物粗提物，適量添加0.1%的吐溫-80，分別制成濃度為10、20、40 mg/mL的供試溶液。將試驗分5組進行，分別為魚腥草、夾竹桃、馬尾松、生姜和香樟乙醇粗提物各濃度供試液，每個處理3次重復。

1.2.2菌絲生長抑菌活性的測定采用菌絲生長速率抑制法，分別取上述5種已經配制成系列濃度梯度的植物粗提物，加入到融化好的PDA培養基中，滅菌，制成系列濃度梯度的含藥培養基平板。取供試的稻瘟病菌菌種，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，然后將菌餅移到上述含藥的培養基平板中央，以不加藥的平板培養基為對照，每個處理3次重復，25 ℃全黑暗培養?！笆弊纸徊娣y定各處理的菌落直徑，并根據公式計算菌絲抑制生長率及EC50值[11]。

抑制生長率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

采用回歸分析法對5種植物乙醇粗提物各處理濃度的對數值（x）和菌絲生長抑制率的概率值（y）進行分析處理，計算出5種植物乙醇粗提物對供試菌株的EC50值。

1.2.3孢子萌發抑菌活性的測定采用米糠培養基產孢的方法，取培養好的菌絲塊，分多點接種到米糠培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，待菌絲長滿，將少許無菌水倒入培養皿中，用毛筆輕輕刷洗過后，再置于365 nm黑光燈下培養，48 h后，培養基表面即產生大量孢子，表現為1層青灰色的新鮮霉層，即為稻瘟病菌孢子。刷洗霉層，過濾、鏡檢，調配成所需濃度的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察，以不加藥劑的孢子懸浮液為對照，分別在處理的孢子懸浮液中加入不同濃度的不同藥劑，每個濃度處理設3個重復[12-15]。

將各處理的孢子懸浮液置于搖床中培養24 h后，鏡檢各處理的孢子萌發情況，記錄200個孢子中萌發的孢子數。孢子萌發抑制率=（對照萌發率-處理萌發率）/對照萌發率×100%。計算抑制率，求出毒力回歸方程、相關系數r和EC50值[16]。

2結果與分析

2.1植物乙醇粗提物對菌絲的抑制作用

由表2可知，5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌菌絲均有抑制作用，在測定的濃度下，隨著各粗取物處理濃度的升高，稻瘟病菌菌落增長直徑遞減，抑制率升高，粗提物濃度與抑制率正相關。當濃度為40 mg/mL時，馬尾松粗提物對稻瘟病菌菌絲的抑制率為62.23%，姜粗提物抑制率也達到了5123%，其次是夾竹桃和香樟，在相同濃度下，魚腥草對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率最低。

2.2植物乙醇粗提物對孢子萌發的抑制作用

從表4可以看出，5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌孢子萌發均有抑制作用，其中馬尾松對孢子萌發的抑制效果最明顯，隨著濃度升高，抑制率逐漸上升，當濃度為10 mg/mL時，抑制率達到了42.56%；當濃度為40 mg/mL時，抑制率達到了65.64%。夾竹桃、姜和香樟的粗提物在濃度是 40 mg/mL 時，其抑制率均超過40%。其中魚腥草的孢子萌發率相對較

3討論

植物的抑菌殺菌作用是長期與昆蟲和病原菌進化產生的結果，主要依賴于植物的次生代謝產物[17-18]。該試驗探究了5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌菌絲生長及孢子萌發的影響，結果表明5種植物粗提液對稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時，馬尾松對該菌的菌絲生長及孢子萌發的抑制率最高，分別為62.23%和65.64%，抑制效果顯著優于其他4種植物粗提物；當濃度為20 mg/mL時，姜和夾竹桃對菌絲抑制率為44.17%和34.98%；其中魚腥草對該菌的抑制活性相對較弱。線性毒力方程結果分析，5種植物粗提物處理濃度與對菌絲生長及孢子萌發的抑制率呈線性關系，其中馬尾松的EC50值為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL。不同植物中存在不同的抗菌活性物質，它們的作用機制存在差異[19]。

本試驗只研究了5種植物的乙醇粗提物，其有效成分復雜，為了解對稻瘟病菌有生物活性的主要成分及相互間的作用效果，有必要對高活性物質分離、純化、分析其活性及化學成分，且其具體抑菌機理有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Skamnioti P，Gurr S J. Against the grain：safeguarding rice from rice

[KG1*2/3]blast disease[J]. Trends in Biotechnology，2009，27（3）：141-150.

[2]廖乾生. 抗稻瘟病菌附著胞形成研究[D]. 杭州：浙江大學，2002.

[3]徐敬友，吳翠萍，童蘊慧. 江蘇水稻旱育秧“黃枯”病原鑒定及致病力研究[J]. 植物病理學學報，2001，31（3）：230-235.

[4]張清麗. 淺談黑龍江省水稻稻瘟病的發生與防治[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2007，27（3）：115-116.

[5]卜元卿，孔源，智勇，等. 化學農藥對環境的污染及其防控對策建議[J]. 中國農業科技導報，2014，16（2）：19-25.

[6]Durham S. Detectives search for antimicrobial-resistant organisms[J]. Agricultural Research，2005，53（3）：18.

[7]費有春. 簡明農藥詞典[M]. 北京：化學工業出版社，1985.

[8]中國科學院上海藥物研究所. 中草藥有效成分提取與分離[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1983.

[9]馮俊濤，祝木金，于平儒，等. 西北地區植物源殺菌劑初步篩選[J]. 西北農林科技大學學報，2002，30（6）：129-133.[ZK）]

[10]黃建等. 三種藥劑對煙草黑脛病防治效果研究[J]. 安徽農業科學，2014，42（6）：1681-1682.

[11][JP3]張偉，廖靜靜，朱貴李，等. 8種植物揮發物和浸提液對三七根腐病菌的抑制活性研究[J]. 中國農學通報，2013，29（30）：197-201.

[12]楊玉萍，李艾蓮. 植物源殺菌劑研究進展[J]. 中國農業科技導報，2006，8（1）：49-53.

[13]鄭雯，張亞玲，辛惠普，等. 水稻稻瘟病菌孢子萌發的化學抑制[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2004，16（4）：13-15.

[14]雷志清，楊雪梅. 水稻稻瘟病菌的發生及防治[J]. 現代農業科技，2009（3）：56-58.

[15]張應烙，尹彩萍，馮駿濤，等. 植物源殺菌劑的研究進展[J]. 西南民族大學學報，2005，31（3）：402-409.

[16]趙善歡. 植物化學保護[M]. 3版. 北京：中國農業出版社，2000.

[17]王法紅，曹陽，駱焱平. 21種海南植物粗提物生物活性初步測定[J]. 湖北農業科學，2013，25（8）：1829-1832.

[18]閻鳳鳴. 化學生態學[M]. 北京：科學出版社，2003.

[19]鄧業成，畢秀蓮，楊林林，等. 紅樹植物苦郎樹提取物及其活性成分對植物病原真菌的抑菌活性研究[J]. 湖北農業科學，2012，51（10）：2010-2013.

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