松杉靈芝分離純化及ITS分子鑒定

鄒莉+孫婷婷+王旭彤+方釋慧+王世新+崔嶸

摘要：以采自黑龍江省大興安嶺圖強地區的野生松杉靈芝為試驗材料，采用組織分離法分別對其菌蓋處、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處的組織進行分離純化；通過測定生長速度和污染率等方法，研究分離純化的最適培養基和最佳部位；最后將分離物進行ITS序列分析，計算遺傳距離，并采用鄰接法構建NJ系統發育樹。結果表明，分離純化最適培養基為PDA+子實體煮水培養基；菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲生長速度快，菌絲長勢好，污染率低；分離物經ITS序列測定，系統發育分析證實其為松杉靈芝。本研究獲得了松杉靈芝的純培養菌株，為松杉靈芝的進一步開發利用提供科學依據。

關鍵詞：松杉靈芝；組織分離；ITS序列分析；系統發育分析

中圖分類號： S567.3+10.1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0278-03

松杉靈芝（Ganoderma tsugae Murr.）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]，是一種生長于針葉樹上的靈芝，是靈芝中的上品[2]。松杉靈芝入藥在我國已有悠久的歷史，是中藥寶庫中一味珍貴藥材，具有增強免疫、抑制腫瘤、保肝解毒、安神健腦、調節消化系統機能、潤肺平喘、抗氧化、美容養顏等多種功效[3-4]。近年來，由于人為地無序采摘，加之生態條件的異常變化，目前野生松杉靈芝已到了一芝難求的狀況[5]。本研究以采自黑龍江省大興安嶺地區的野生松杉靈芝為試驗材料，通過組織分離法對其進行菌種分離純化以及ITS序列測定，為今后深入研究松杉靈芝和進一步實現人工馴化栽培及產業化發展奠定良好的基礎。

1材料與方法

1.1供試菌種

以采自黑龍江省大興安嶺圖強林業局過火樹樁上的松杉靈芝作為供試種菇，試驗材料選擇朵形正常、無病害、無蟲孔、無破損、生長健壯的子實體。

1.2試驗方法

1.2.1培養基的制備

本試驗共4種培養基，基礎培養基為PDA培養基，碳源為葡萄糖，其他培養基分別添加前人研究的最適氮源和無機鹽等作為比較。

PDA培養基（A）：馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH值自然。將馬鈴薯切成1 cm×1 cm×1 cm 小塊放于鍋中加水煮20～30 min，過濾取濾液，加入葡萄糖與瓊脂煮沸4～5 min，分裝于三角瓶中，滅菌。滅菌采用高壓蒸汽滅菌，121 ℃滅菌20 min。

PDA+酵母膏培養基（B）：在1 L PDA培養基中加入5 g酵母膏[6]配制而成的培養基。

PDA+無機鹽培養基（C）：在1 L PDA培養基中加入1 g MgSO4、3 g KH2PO4[7]配制而成的培養基。

PDA+子實體煮水培養基（D）：松杉靈芝子實體用水煮后的濾液代替水配制而成的培養基。

1.2.2子實體不同部位對分離的影響

采集野外過火樹樁上的松杉靈芝，選取新鮮尚未完全成熟的子實體作為分離材料，用75%乙醇擦拭2～3遍后置于超凈工作臺中，在無菌條件下進行菌種分離。用無菌解剖刀分別在松杉靈芝子實體的菌蓋、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處切取菌肉組織塊，接種在PDA平板培養基中，每個培養皿接1塊菌肉，20組重復，用封口膜進行封口后置于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，每天觀察長勢并記錄。

1.2.3不同培養基對分離的影響

分別制備“1.2.1”中的4種培養基，對松杉靈芝進行分離培養。從上述試驗選出的最佳分離部位處取菌肉接于4種培養基中，每個平板接種1塊菌肉，重復20組，于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，觀察菌絲長勢并記錄。

1.2.4DNA的提取、擴增和鑒定

采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒（天根，北京）分別對松杉靈芝的子實體和分離培養得到的菌絲體進行基因組 DNA 的提取。子實體用無菌的接種鉤鉤取其純凈的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨；菌絲體用無菌的小勺在分離培養基上刮取后放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）用于rDNA ITS 區段的 PCR 擴增[8]。擴增體系為50 μL，其中去離子水為35.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，ITS1、ITS4 引物各2 μL，Taq DNA 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 1 μL（濃度20～50 ng/μL）；PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃反應7 min。對PCR擴增產物進行電泳檢測后送至哈爾濱博仕公司進行測序。

將測序結果在NCBI中作BLASTN比對，找出并下載>95% 相似性序列，用ClustalX 2.0的Alignment程序對所有同源序列進行多重對位排列。用MEGA 5.0軟件包進行系統發育分析和進化樹的構建。用Kimura2-parame-ter 模式計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位或缺失數據作完全刪除處理，進化距離分析采用鄰位相連法（NJ，neighbor-joining）。系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以自展法進行檢驗，重復1 000次。

2結果與分析

2.1子實體不同部位對分離的影響

由表1可知，從松杉靈芝子實體的不同部位所取菌肉組織進行培養后，其中菌蓋與菌柄交界處的菌絲生長速度與其他2個部位相比差異極顯著，菌絲長勢最旺盛，生長速度最快，且污染率最低，都顯著低于其他2個部位的平均污染率。因此，菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位。

3結論與討論

本試驗采用組織分離法對野生松杉靈芝進行分離純化，結果表明，野生松杉靈芝可在實驗室條件下成功分離。通過對子實體分離得出結論：菌蓋和菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲不但生長致密潔白、生長速度快，而且菌蓋和菌柄交界處的菌肉組織與外界真菌及細菌無直接接觸，在該部位進行分離，可有效降低菌絲受污染的概率；此外，本試驗篩選出最適宜分離的培養基為PDA+子實體煮水培養基，用該培養基進行組織分離能提高菌絲生長速度，原因可能是子實體煮水后含有菌絲生長所必需的營養物質和微量元素。

在核基因組研究中，常用核糖體 DNA 內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，rDNA ITS 區）序列對植物和真菌進行鑒定和系統進化分析[9-11]。在進化過程中 ITS 區所受到的選擇壓力非常小，并且進化速率較快，在大部分的真核生物中都表現出較為廣泛的序列多態性。親緣關系很近的2個種都能通過ITS序列來顯示其差異性，表現出二者的系統進化關系[12-14]。

本試驗采用ITS序列比對法進行松杉靈芝菌種的鑒定，其準確性高且簡單易行。通過對供試子實體與菌絲體的ITS區段長度進行比對，驗證供試菌絲體為松杉靈芝的分離物；構建系統發育樹后驗證供試菌絲體與Ganoderma tsugae、Ganoderma oregonense有較近的系統發育關系，為今后松杉靈芝的進一步開發利用提供了種質資源與科學依據。

參考文獻：

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