活性氧自由基在試驗性乳腺炎大鼠發病機制中的作用

顧蓓蓓??+盧勁曄??+馬卉??+盧煒??+劉靜

摘要：為探討活性氧自由基在宿主抵抗乳腺感染中的作用，選取36只清潔級SD懷孕大鼠，于產后72 h經乳頭管灌注10 μg/側脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）至第4對乳腺（兩側）內。分別于灌注前（定義為0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）頸靜脈放血處死動物，采集樣品。結果顯示，LPS誘發乳腺炎引起白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達顯著升高，從而促進嗜中性粒細胞（neutrophil，PMN）遷徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的釋放。乳腺組織N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）活力與ROS釋放變化結果一致，LPS灌注后各時間點均顯著升高，并于灌注后8 h達到峰值。結果表明，PMN是宿主抵御乳腺感染的主要效應細胞，通過釋放ROS消滅病原菌，但大量釋放的ROS也是引起組織損傷的重要原因。

關鍵詞：活性氧；中性粒細胞；乳腺炎；大鼠

中圖分類號： R979.5文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0294-03

乳腺炎是危害奶牛產業的一種重要疾病，誘發因素眾多，其中以病原菌感染最為嚴重。目前，臨床上分離的乳腺炎致病菌超過137種，根據病原來源和傳播方式可分為傳染性病原和環境性病原兩大類。大腸桿菌是環境性病原的代表，也是臨床型乳腺炎中最常見的類型。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是大腸桿菌細胞壁的組成成分，是大腸桿菌引起炎癥反應的主要致病因子。研究表明，LPS誘發的試驗性乳腺炎具有炎癥反應一致、重復性高的優點，是研究大鼠乳腺炎發病機制的理想模型。

病原菌入侵宿主是復雜、動態的多因子作用過程，從病原與宿主互作的角度研究病原侵染后的致病機制，以及從分子水平了解宿主的免疫反應是控制疾病的關鍵所在。已有研究證實，活化的PMN通過釋放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）殺滅病原微生物，ROS是分子氧在還原過程中的一系列代謝中間產物，主要包括 O-2[KG-2]· [KG-3]、H2O2、HOCl、·OH 等[1-2]。對胞內感染菌的研究發現，ROS的產生對清除胞內微生物是必需的，但持續過度激活產生過量氧化劑，超過局部抗氧化劑的防御反應時會降解蛋白多糖，降低細胞外基質與乳腺上皮的黏附性，引起乳腺上皮細胞死亡、脫落及泌乳功能的損傷[3-4]。深入了解ROS在宿主抗乳腺感染過程中的作用具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗動物

36只清潔級懷孕SD大鼠購自上海實驗動物中心。于產后72 h誘發試驗性乳腺炎，經乳頭管注入10 μg/側LPS至大鼠第4對乳腺（兩側）內。分別于灌注前（定義為0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）頸靜脈放血處死動物，收集血清、肝素抗凝血、乳腺組織用于后續分析。

1.2主要試劑與儀器

LPS（O55：B5）、乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、雙氫羅丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）均購自Sigma公司。TRIzol購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑、隨機引物、M-MLV、dNTPs均購自Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix購自Toyobo公司。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）放免試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免所。

FMJ-182型放射免疫γ計數器（中國科學院上海原子核研究所日環儀器廠），UV755B型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），BH2型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），組織勻漿器（瑞士Kinematica AG），核酸濃度測定儀（德國Eppendorf Biophotometer），7300型熒光定量PCR儀（ABI Prism），流式細胞儀（美國BD Biosciences）。

1.3測定指標及方法

1.3.1組織勻漿及蛋白濃度的測定準確稱取1 g乳腺組織加入生理鹽水6 mL，冰浴勻漿后于10 000 g 4 ℃離心 30 min，上清液于-20 ℃冰箱保存備用。使用前采用 Bradford 法測定蛋白濃度。

1.3.2乳腺組織與血清中NAGase、MPO、IL-8的測定

乳腺組織與血清中NAGase、MPO、IL-8的測定按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3定量PCR檢測乳腺組織細胞間黏附分子-1 mRNA表達

采用TRIzol試劑盒提取總RNA，用隨機引物同時對所有樣品進行反轉錄，建立各樣品的cDNA。采用所有待測RT產物的混合樣對反應條件進行優化。反應條件為：95 ℃預變性1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45個循環。ICAM-1、β-actin基因引物參考已發表的文獻，ICAM-1基因編號為NM_012967，上游：5′-GAACTGGACCTG GCAAGA G-3′；下游：T法進行數據分析。

1.3.4流式細胞術測定外周血PMN活性氧釋放

將100 μL 全血加入終濃度為100 ng/mL的PMA刺激PMN，同時設無PMA刺激對照（等量PBS代替PMA）；于37 ℃靜置15 min后加入DHR123工作液，終濃度為5 μmol/L，于37 ℃下孵育 10 min；裂解紅細胞，以0.01 mol/L、pH值7.2的PBS洗滌2次并重懸于PBS中，混勻后采用流式細胞儀檢測。

檢測前采用陰性對照樣品優化儀器條件。首先在FSC/SSC二維散點圖上調節FSC放大器增益、SSC電壓、FSC閾值使PMN細胞群在圖中清晰可見，確定PMN細胞的位置，設門于R1；FL1通道（波長530 nm）檢測熒光強度，調節光電倍增管增益使陰性對照熒光強度在FL1直方圖上介于0～101；依次檢測無刺激對照和PMA刺激樣品，每個樣品獲取10 000個細胞。以上試驗重復3次，結果以平均熒光強度表示。

1.4數據處理

采用SPSS 17.0方差分析軟件對試驗數據進行統計分析，統計結果以“平均值±標準誤”（x[TX-5]±s）表示。

2結果與分析

2.1灌注LPS后乳腺組織與血清中IL-8的活性變化

由圖1可見，與0 h相比，LPS灌注后8、16 h乳腺組織 IL-8 含量顯著升高（P<0.05），LPS灌注后各時間點血清中IL-8含量均顯著升高（P<0.05）。

2.2灌注LPS后乳腺組織與血清中MPO的活性變化

由圖2可見，灌注LPS后，乳腺組織中MPO活性迅速上升，與0 h相比差異顯著（P<0.05），峰值出現于灌注后8 h（P<0.05）。血清中MPO活性的變化規律與組織中相反，與0 h相比MPO活性先下降后上升，最低點出現于LPS灌注后4 h（P<0.05），至24 h有所恢復。

2.3乳腺組織[WTBX][STBX]ICAM-1[WTBZ][STBZ] mRNA表達的變化

試驗結果（圖3）顯示，在乳腺灌注LPS后的各時間點，乳腺組織中[WTBX][STBX]ICAM-1[WTBZ][STBZ] mRNA相對表達均顯著升高（P<0.05）；灌注后24 h表達呈下降趨勢，但仍顯著高于0 h。

2.4外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態變化

[JP3]試驗結果（圖4）顯示，灌注LPS后的各時間點，外周血PMN活性氧釋放均顯著升高（P<0.05），峰值出現于灌注后8 h。

2.5灌注LPS后乳腺組織與血清中NAGase的活性變化

灌注LPS后的不同時間點，乳腺組織中NAGase活性均顯著升高（P<0.05），于灌注后8 h達到峰值。血清中NAGase活性的變化規律與組織中一致，灌注后8 h NAGase活性顯著升高（P<0.05），灌注后16 h已恢復至正常水平（圖5）。

3結論與討論

病原菌入侵宿主是復雜、動態的多因子作用過程，從病原與宿主互作的角度研究病原侵染后的致病機制，以及從分子水平了解宿主的免疫反應是控制疾病的關鍵所在[8]。作為機體最大的外分泌腺，乳腺在進化、發育、泌乳再構建的過程中[CM（25]時刻面臨著病原微生物的侵襲。億萬年來， 在與病原微生[CM）]

物的斗爭過程中，乳腺進化出了復雜而精細的自主防御機制。目前對宿主抗乳房感染的研究尚不深入，這是無法有效控制乳腺炎的原因之一。

循環血液中大量的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙，這是發生乳腺炎的重要特征。已有研究表明，細菌入侵后通過激活NF-κB/AP-1刺激單核細胞、巨噬細胞產生多種趨化因子，從而促進PMN等吞噬細胞的趨化[9-10]。IL-8是炎癥發生時一種重要的趨化因子，對PMN具有激活作用，可誘導其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類、整合素上調、呼吸爆發等[11-12]。LPS灌注后的各時間點，血清中IL-8均顯著升高，乳腺組織中IL-8在灌注后8、16 h顯著升高，提示細菌入侵后促進機體分泌 IL-8，促進PMN趨化進入病灶發揮吞噬活性。此結果被MPO的活性變化規律證實。MPO是PMN的標志酶，MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度[5]。灌注LPS后，乳腺組織中MPO活性升高，同樣于灌注后8 h達到峰值；血清中MPO活性的變化則與組織中相反，呈先降低后升高的趨勢，動態反映了循環血液中PMN向乳腺組織遷徙的過程。

PMN是機體抵抗感染的主要非特異性防御細胞，任何PMN的功能障礙均會影響乳用家畜的生產性能。ICAM-1廣泛表達于各種細胞表面，對細胞間的相互作用及PMN的黏附聚集具有重要作用[13]。已有研究表明，ICAM-1在感染性疾病中發揮著重要作用[14-15]，但其在乳腺炎發病機制中的作用報道較少。本研究表明，在LPS誘發的大鼠試驗性乳腺炎模型中，乳腺組織中ICAM-1 mRNA表達顯著升高，提示LPS刺激乳腺后通過上調ICAM-1表達，促進PMN黏附至乳腺組織。PMN進入宿主乳腺組織，主要通過釋放ROS實現吞噬病原微生物[5]。在對一些胞內感染菌的研究中發現，ROS的產生對清除胞內微生物是必需的。本研究結果顯示，LPS灌注乳腺后的各時間點，ROS均顯著升高，ROS是宿主抵御乳腺感染的主要效應分子。然而，ROS的產生在殺滅病原微生物的同時，對宿主細胞和吞噬細胞本身也會造成損傷。ROS釋放的峰值伴隨著NAGase活性的顯著增加，NAGase是一種酸性水解酶，乳汁中的NAGase主要來源于乳腺上皮細胞與白細胞，NAGase活性的高低是細胞受損程度的重要指標[7，16]。LPS灌注后4、8、16 h，NAGase活性急劇升高，并于8 h 達到峰值，于24 h恢復至正常水平。

在病原微生物或其他活性分子的作用下，大量循環血液中的PMN向乳腺組織遷徙，釋放活性氧消滅病原微生物，但高毒性的活性氧也會引起乳腺組織的損傷。如何迅速啟動機體的免疫反應，促進PMN等效應細胞第一時間遷徙至乳腺組織發揮吞噬效應，以及大量被激活的PMN能否迅速從乳腺腺泡清除，均決定了乳腺炎癥的轉歸。本研究深入探討了宿主識別和清除乳房致病因子感染的天然免疫機制，對臨床上乳腺炎的免疫調控及防治具有重要現實意義。

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