清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取來，李晶晶，郭學武，肖冬光*

（1.教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室天津300457，2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取來1,2，李晶晶1,2，郭學武1,2，肖冬光1,2*

（1.教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室天津300457，2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

研究了乳酸質量濃度和pH對清香型大曲酯化酶活力的影響，結果表明，乳酸質量濃度對大曲酯化酶活力有很大影響，當乳酸質量濃度較低時，大曲中的酯化酶表現為合成作用，分別在低于8 g/L和16 g/L時催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；當乳酸質量濃度較高時，酯化酶表現為水解作用，將酯分解為相應酸和醇；pH對大曲酯化酶酯分解活力影響顯著，在pH值為2.0時，酯的分解主要為化學分解，在pH值為3.0～6.0時，化學分解和酯化酶分解都起作用。實驗發現在pH值為4.0時大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最強，100 h時乙酸乙酯質量濃度達188.8 mg/L；pH值為5.0時催化乳酸乙酯合成的活力最強，100 h時乳酸乙酯質量濃度達182.6 mg/L。

清香型大曲；酯化酶；合成；分解

清香型白酒的歷史源遠流長，它的主體香氣是乙酸乙酯和乳酸乙酯[1]。其特點是清香純正、自然協調、醇甜柔和、后味爽凈[2]。白酒中酯類的形成大體有三條途徑：一是微生物代謝副產物，二是酒醅中酸和醇在化學或大曲酯化酶作用下合成，三是白酒蒸餾和貯藏過程中通過化學反應形成。王濤等[3-4]認為酒中乙酸乙酯是產酯酵母胞內酶的代謝產物，酯化以前中期為主；李河等[5]認為乳酸乙酯一是配醅帶入，二是酒醅中大量乳酸而形成。酸和醇通過化學反應生成酯是一個緩慢的過程，達到平衡往往需要很長時間[6]。

大曲在釀造過程中為發酵、產香提供了微生物群系和風味前驅物質，而且也提供了豐富的生物催化劑酶。大曲中的酯化酶能使一個酸元和一個醇元結合、脫水而生成酯，大大加速了酯的形成速率，但是大曲酯化酶也能分解酯，生成相應的酸和醇[7-9]。對酯化酶的研究始于20世紀80年代，多研究酯化酶在濃香型白酒中對己酸乙酯的合成作用[10]。對于清香型白酒，其主體香氣為乙酸乙酯和乳酸乙酯，研究清香型大曲的酯化酶活力，有利于了解大曲酯化酶對乙酸乙酯形成的補充作用及其在乳酸乙酯形成中的作用[11]。針對白酒發酵過程中乳酸含量較高的特點，本實驗研究了乳酸質量濃度和pH對清香型大曲酯化酶活力的影響[12]。有利于了解發酵過程中乳酸對大曲酯化酶活力的影響，分析清香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成機制，解決清香型白酒中乳酸乙酯含量過高的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型大曲：儲存3～6個月，某清香型白酒廠提供。乙酸、乳酸、乙醇（均為分析純）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent HP-INNOWAX氣相色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：Agilent有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業醫療設備廠有限公司；ES-3610K電磁爐：成都川西行料工貿有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸質量濃度對大曲酯化酶活力的影響

在體積分數20%乙醇溶液中，添加1 g/L乙酸、5 g干曲，乳酸質量濃度分別為4 g/L、6 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L，30℃保溫酯化100 h。同時做不加曲的空白對照實驗，測定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.2 pH對大曲酯化酶活力的影響

在體積分數20%乙醇溶液中，添加2 g/L乙酸、3 g/L乳酸，再加5 g干曲，用NaOH或H2SO4分別調pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，于30℃靜置100 h，同時做不加曲的空白對照實驗，測定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.3 pH對大曲酯化酶主要酯分解活力的影響

在體積分數20%乙醇溶液中分別按體積量加入0.1%的乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸異戊酯；分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL；分別加入pH為3.0、4.0、5.0的檸檬酸緩沖溶液10 mL，加5 g干曲，于30℃靜置100 h。同時做不加曲的空白對照實驗，測定不同酯的分解率。

1.3.4 分析方法

（1）風味物質的測定

量取100 mL酯化液于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，加熱蒸餾，接收蒸出液100 mL，采用載氣為高純氮氣，進樣口溫度200℃，檢測器溫度150℃，程序升溫（起始溫度50℃，保持8min，以5℃/min升至150℃，保持15min），分流比為10∶1，進樣體積為1 μL的氣相色譜法檢測乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯等風味物質的含量[13-14]；對照組在蒸餾之前加曲。

（2）酯分解率測定

量取100 mL混合液于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，加熱蒸餾，接收蒸出液100 mL，采用1.3.4（1）中的氣相色譜法檢測各酯含量；對照組在蒸餾之前加曲，酶分解率計算公式如下。

2 結果與分析

2.1 乳酸質量濃度對大曲酯化酶活力的影響

酸類物質是白酒中酯合成的前體，乳酸、乙酸是清香型白酒發酵中重要的兩種酸。傳統清香型白酒發酵過程中，酒醅中乙酸含量在1 mg/g左右，乳酸含量達20 mg/g左右[15]。添加不同質量濃度乳酸對大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的影響，結果如表1、表2所示。

表1 乳酸質量濃度對大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影響Table 1 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl acetate byDaquesterifying enzymes

由表1可知，在對照組中，乙酸乙酯含量隨乳酸質量濃度的增加而增加；而添加大曲后，乙酸乙酯含量隨乳酸質量濃度的增加呈下降趨勢；差值逐漸減小并成為負數。說明當乳酸質量濃度較低時，大曲中的酯化酶表現為合成作用，催化乙酸乙酯的合成；隨乳酸質量濃度的增加，大曲酯化酶對乙酸乙酯合成作用減弱；至乳酸質量濃度為16 g/L時，大曲酯化酶表現為水解作用?？赡苁沁^高的乳酸含量改變了酶的活性中心，使其更偏向于分解反應，或乳酸與乙酸產生競爭性抑制作用等。

表2 乳酸質量濃度對大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 2 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl lactate byDaquesterifying enzymes

由表2可知，對照組中，隨乳酸質量濃度的增加，乳酸乙酯含量呈增加趨勢；添加大曲后，乳酸乙酯含量上升速度明顯較對照組緩慢；差值由正值變為負值。說明當乳酸質量濃度較低時，大曲中的酯化酶表現為合成作用，催化乳酸乙酯的合成；隨乳酸質量濃度的增加，酯化酶對乳酸乙酯合成活力在下降；至乳酸質量濃度為8 g/L時，大曲酯化酶表現為水解作用。

在對照組中，酯類的合成為單純的化學作用，乳酸質量濃度的增加不僅使乳酸乙酯含量增加，還能促進乙酸乙酯的合成；添加大曲后，在體積分數20%乙醇溶液中，微生物被抑制，基本不發揮作用；酯的合成是化學合成和酯化酶催化共同作用的結果。差值可以反映大曲中的酯化酶在酯的合成中起到的作用。隨乳酸質量濃度的增加，差值逐漸由正值變為負值，說明大曲中的酯化酶在酯合成中的作用在變化，由合成作用變為水解作用。分析原因可能是過高的酸濃度使酯化酶的結構發生了變化，增強了其分解活力；還可能是大曲作為pH的緩沖劑，影響了酸強度，減弱了酯的合成。

2.2 pH對大曲酯化酶活力的影響

酶的活性受環境pH影響極為顯著，只有在一定pH值范圍內，酶才表現出活性。pH對大曲酯化酶合成乙酸乙酯及乳酸乙酯的影響，結果如表3、表4所示。

表3 pH對大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影響Table 3 Effect of pH on the synthesis of ethyl acetate byDaqu esterifying enzymes

由表3可知，在對照組中，隨pH增大，乙酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0時乙酸乙酯合成量下降顯著，pH＞3.0時，合成量都很低。添加大曲后，隨pH增大，乙酸乙酯含量出現反復升降，在pH為2.0時出現最大值，6.0時有最小值。pH值為2.0時，差值為負數，說明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化學合成為主；pH＞3.0，差值均為正值，說明pH＞3.0時，大曲中的酯化酶能促進乙酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化為主；pH＞4.0，酯化酶對乙酸乙酯的合成能力下降。綜上分析，大曲中酯化酶合成乙酸乙酯的最適pH值在4.0左右。

表4 pH對大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 4 Effect of pH on the synthesis of ethyl lactate byDaqu esterifying enzymes

由表4可知，在對照組中，隨pH增大，乳酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0乳酸乙酯合成量下降顯著，pH＞3.0時，合成量都很低。添加大曲后，隨pH增大，乳酸乙酯含量呈先下降后上升再下降趨勢，在pH值為2.0時出現最大值，3.0時有最小值。pH值為2.0時，差值為負數，說明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化學合成為主；pH＞3.0，大曲中的酯化酶能促進乳酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化為主；pH＞5.0時，大曲酯化酶對乳酸乙酯合成能力下降。綜上分析，大曲酯化酶合成乳酸乙酯最適pH值為5.0左右。

2.3 pH對大曲酯化酶主要酯分解活力的影響

在含乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯的乙醇溶液中，加入pH值為3.0、4.0、5.0的檸檬酸緩沖溶液、大曲，不同時間條件下蒸酒測各種酯含量的變化。研究不同pH緩沖溶液中大曲酯化酶對各酯分解隨時間的變化情況，結果見圖1～圖3。

2.3.1 pH值對大曲酯化酶分解乙酸乙酯的影響

圖1 不同pH緩沖溶液中乙酸乙酯的分解率Fig.1 Decomposition rate of ethyl acetate in different pH buffer solution

由圖1可知，在對照組中，pH變化對乙酸乙酯的分解有一定影響，三種pH條件下，乙酸乙酯分解趨勢基本一致。添加大曲之后，在pH為3.0的緩沖體系中，乙酸乙酯分解趨勢與對照實驗相似，說明pH為3.0時，大曲酯化酶分解活力不高，對乙酸乙酯的分解不起作用，乙酸乙酯的分解以化學分解為主；pH為4.0和5.0時，乙酸乙酯分解速率加快，酯化酶表現出較強的分解活力，乙酸乙酯的分解以大曲酯化酶分解為主。說明在較低pH條件下，大曲酯化酶對乙酸乙酯分解活力低，有利于其維持在一個較高的濃度，pH變大，大曲酯化酶對乙酸乙酯分解活力加強。

2.3.2 pH值對大曲酯化酶分解乙酸異戊酯的影響

由圖2可知，對于乙酸異戊酯，其分解較為迅速，在第10天時，pH=3.0對照、pH=3.0實驗、pH=4.0對照、pH=4.0實驗、pH=5.0對照、pH=5.0實驗組分解率分別為57.96%、82.56%、60.98%、91.97%、66.34%、94.96%，隨pH增大，乙酸異戊酯分解速率加快。添加大曲后，三種pH條件下，分解速率都大于對照組，說明化學分解和大曲酯化酶對乙酸異戊酯的分解都起作用。在三種pH條件下，大曲酯化酶對乙酸異戊酯分解活力都較強。酯的合成和分解是可逆反應，在實驗體系中，乙酸和異戊醇的含量都很低，故分解速率遠遠大于合成速率，表現為酯含量下降。

圖2 不同pH緩沖溶液中乙酸異戊酯分解率Fig.2 Decomposition rate of isoamyl acetate in different pH buffer solution

2.2.3 pH值對大曲酯化酶分解乳酸乙酯的影響

圖3 不同pH緩沖溶液中乳酸乙酯的分解率Fig.3 Decomposition rate of ethyl lactate in different pH buffer solution

由圖3可知，對于乳酸乙酯的分解，在第10天時pH= 3.0對照、pH=3.0實驗、pH=4.0對照、pH=4.0實驗、pH=5.0對照、pH=5.0實驗組分解率分別為26.32%、9.89%、8.07%、8.15%、2.36%、10.30%。對照組中，pH越小，乳酸乙酯的分解越快；添加大曲后，乳酸乙酯分解速率基本相同。在pH為3.0的緩沖體系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率減小，說明大曲酯化酶起到合成作用，抑制乳酸乙酯的分解，全部為化學分解；在pH為4.0的緩沖體系中，添加大曲對分解速率基本無影響，說明大曲酯化酶基本不起作用，化學分解作用為主；在pH為5.0的緩沖體系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率顯著增加，說明兩種分解都起作用，大曲酯化酶分解作用為主。

3 結論

乳酸質量濃度對大曲酯化酶活力有很大影響，當乳酸質量濃度較低時，大曲中的酯化酶表現為合成作用，分別在低于8 g/L和16 g/L時催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；當乳酸質量濃度較高時，大曲中的酯化酶表現為水解作用，將酯分解為相應酸和醇。發酵過程中，乳酸質量濃度逐漸增加。發酵前期，酯化酶對乙酸乙酯和乳酸乙酯有一定合成作用，當乳酸質量濃度過高時，酯化酶表現為抑制酯的合成，對降低乳酸乙酯含量有一定的積極意義。

pH對大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯顯著影響，pH較低（pH=2.0）時，酯的合成以化學合成為主，酯化酶起分解作用；pH在3.0～6.0范圍內，酯的合成以大曲酯化酶催化為主。大曲酯化酶對乙酸乙酯和乳酸乙酯合成最適pH不同，pH值為4.0時，大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最強；pH值為5.0時，大曲酯化酶催化乳酸乙酯合成的活力最強。

pH對大曲酯化酶酯分解活力影響顯著，在pH值為2.0時酯的分解主要為化學分解，pH在3.0～6.0時，化學分解和酯化酶分解都起作用。

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Esterifying enzymes activity of light-flavorDaqu

TANG Qulai1,2,LI Jingjing1,2,GUO Xuewu1,2,XIAO Dongguang1,2*(1.Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education,Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,Tianjin 300457,China;2.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

The effects of lactic acid concentration and pH on esterifying enzymes activity were discussed.The results showed that,the lactic acid concentration had great effect on esterifying enzymes activity ofDaqu.When the lactic acid concentration was low,the esterifying enzymes showed synthesis effect,catalysing ethyl lactate(lactic acid less than 8 g/L)and ethyl acetate(lactic acid less than 16 g/L)synthesis.When the lactic acid concentration was high,the esterifying enzymes showed hydrolysis effect,so the ester was decomposed into acid and alcohol.pH showed significant effect on esterifying enzymes decomposition activity ofDaqu,the decomposition of the ester was mainly chemical decomposition at pH 2.0,and chemical decomposition and esterifying enzymes decomposition both play a role at pH 3.0-6.0.The optimum pH for ethyl acetate synthesis by esterifying enzymes was 4.0,which produced 188.8 mg/L ethyl acetate at 100 h,and for the pH 5.0 buffer,it produced 182.6 mg/L ethyl lactate at 100 h.

light-flavorDaqu;esterifying enzymes;synthesis;hydrolysis

TS262.31

0254-5071（2017）01-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.007

2016-06-30

國家自然科學基金資助項目(3147172)；中國白酒3C計劃項目

唐取來(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為現代釀造技術。

*通訊作者：肖冬光(1956-)，男，教授，博士，研究方向為現代釀造技術。