PPARs激動劑體外篩選模型的建立及其在澤瀉活性成分篩選中的應用

李小艷+王小花+黃小強+吳婷婷+許文+吳水生

[摘要]利用酵母GAL4 BD-UAS反式激活分析（transactivation assay）系統在哺乳動物細胞中建立以過氧化物酶體增殖物受體的配體結合結構域（PPARs-LBD，包括PPARα，PPARβ和PPARγ）為靶點的體外篩選模型，并應用該模型對澤瀉化學成分進行篩選，研究澤瀉14種化學成分對PPARs的激活作用。首先構建GAL4 BD-PPARsLBD融合表達質粒pBind-PPARs-LBD，采用Lipofectamine將表達質粒pBind-PPARs-LBD與含有UAS：luciferase報告質粒pGL4.35共轉染293T細胞。以PPARs的激動劑（PPARα：非諾貝特；PPARβ：L165041；PPARγ：羅格列酮）為陽性對照，通過測定螢火蟲熒光素酶活性來驗證系統是否構建成功，并用該系統來考察澤瀉中14種化學成分對PPARs靶點激活的影響。PPARs的陽性激動劑結果顯示系統構建成功，用該系統分析澤瀉化學成分結果顯示澤瀉單體化合物5，6，7，8，13，14對PPARα有激活作用，化合物5，7對PPARβ有激活作用，而化合物6，7，8，12對PPARγ有激活作用，其中化合物12對PPARγ有顯著激活能力。該研究在哺乳動物293T細胞中成功構建以PPARα/β/γ配體結合結構域為靶點的體外篩選細胞模型，并成功應用于澤瀉PPARα/β/γ的天然激動劑的篩選。

[關鍵詞]過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）； 激動劑； 澤瀉； 三萜成分

[Abstract]Peroxisome proliferators activated receptors （PPARs） are closely related to human chronic disease， such as diabetes mellitus and the other metabolic diseases. In this study， a cell-based PPARs （PPARα/β/γ） model was developed for the screening of PPARs agonists from Alismatis Rhizoma （AR）. Firstly， 293T cells were transfected with the reconstructed plasmid pBind-PPAR （α，β， orγ）-LBD and reporter gene pGL4.35， and the known PPARs agonists were used as the positive control （fenofibrate for PPARα， L165041 for PPARβ， and rosiglitazone for PPARγ）. The ability of activation for PPARs was evaluated by analyzing the expression value of luciferase. Afterward， the 14 pure triterpenoids isolate from AR were analyzed on the developed PPARα， PPARβ and

PPARγ screening assay method. The results showed that the compounds 5， 6， 7， 8， 13 and 14 from AR have the ability of activation for PPARα. The compounds 5 and 7 from AR have the ability of activation for PPARβ. The compounds 6， 7， 8 and 12 from RA have the ability of activation for PPARγ.In this study， the compound 12 from AR were found to display significant activation on PPARγ for the first time. AR triterpenoids extracts had the ability of activation for PPARα， PPARβ and PPARγ. The results suggested that triterpenoids extracts from AR were PPARα， PPARβ and PPARγ agonists. The results will help to provide reference for clinical application of AR， and establish a model for PPARs on 293T cell， which can be used to screen and evaluate PPARs natural agonists.

[Key words]peroxisome proliferator-activated receptors； agonist； Alismatis Rhizoma； active triterpenoids ingredients

doi：10.4268/cjcmm20162121

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是核激素受體超家族中的配體激活轉錄因子，參與許多與慢性疾病密切相關的臨床生理和病理過程，成為代謝疾?。?型糖尿病、高血脂、心血管疾病等）治療的重要靶點^[1]。其作用機制是PPAR與類維甲酸受體（RXR）形成異源二聚體，再與靶基因啟動子上的PPRE序列結合，之后通過配體的激活誘導輔阻遏物蛋白的分離和輔激活物的募集，形成PPAR活化復合物，導致糖脂代謝、脂質平衡、脂肪細胞分化的基因表達發生改變^[2]。PPARs具有多種生物學效應，調控著大量涉及調節糖脂中間代謝、內穩態、脂肪細胞分化、胰島素敏感、免疫應答、細胞增長和變異的基因表達，是調整糖脂代謝綜合征有效的治療方法，如降脂藥貝特類藥物及降糖藥TZDs類藥物^[3]，但是這些合成藥物如TZDs常常會導致病患體增重、水腫，并增加罹患心肌梗塞的風險，同時還會產生肝毒性；而貝特類降脂藥會增加患膽結石的風險，引起肌肉衰竭等^[4]，從中藥中尋找活性更佳，副作用更小的PPARs激動劑已成為當今制藥研究的熱點和PPARs藥物研發的主要研究趨勢^[5]。

澤瀉Alisma orientale（Sam.） Juzep作為一味傳統中藥，表現出多方面的藥理學活性，包括利尿、神經保護、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化活性^[6]，成為許多傳統中醫藥配方不可或缺的部分。已有文獻表明澤瀉提取物是PPARs的多重激動劑^[7]，但是具體的活性成分尚未闡明，因此，本研究建立PPARs激動劑體外篩選模型并應用澤瀉PPARs相關活性成分的篩選，為澤瀉降脂降糖作用機制提供參考，也為具有潛在PPARs活性的天然藥物活性成分篩選提供一種高通量模型。

1 材料

BCD-248冰箱（中國Haier公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇凈安泰空氣技術有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；HERACELL 150i型CO₂恒溫培養箱（美國Thermo公司）；DK-8D電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；CPA225D 1/10萬分析天平（德國Sartorius公司）；臺式pH計（美國METTLER TOLEDO公司）；TDL-50B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；低溫高速臺式離心機，移液槍（德國Eppendorf公司）；RNA逆轉錄儀，ABi 7900 Quantitative real-time PCR儀（美國ABi公司）；小型垂直電泳槽，小型轉印槽，基礎電泳儀電源及凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；Leica DMIL LED倒置顯微鏡（德國徠卡儀器公司）；FLUO STAR Omega多功能熒光酶標儀（德國BMG LABTECH公司）；GloMax 20/20單管光度計（美國Promega公司）；6孔培養板，24孔板，96孔板，培養瓶（美國Corning Costar公司）。

人胚胎腎細胞株293T，人宮頸癌細胞株HeLa和人肝癌細胞株HuH7（中國科學院上海細胞庫，由本實驗室保存）；pBind，pGL4.35質粒（廈門欣基生物科技有限公司）；大腸桿菌DH5α菌株（由本實驗室保存）。

DMEM培養基，胎牛血清，雙抗（PS）青鏈霉素混合液，胰蛋白酶，PBS緩沖液，磷酸鹽緩沖液（美國Hyclone公司）；TRizol試劑，DEPC-H₂O，Lipofectamine LTX and Plus Reagent 15338-100（美國Invotrogen公司）；DNA聚合酶，限制性內切酶，DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）；cDNA合成試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit，熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ，RT-PCR試劑盒Accu Power 2× Greenstarq PCR Master Mix，DNA純化試劑盒QIA quick PCR purification Kit（日本Takara公司）；質粒提取試劑盒，瓊脂糖，雙熒光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910（美國Promega公司）；AMP（美國Amresco公司）；DMSO， MTT（美國Sigma公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，超敏ECL化學發光試劑盒，Western及IP細胞裂解液，彩色預染蛋白質相對分子質量標準，TBSSDS-PAGE電泳液，Western轉膜液，Western封閉液，Western一抗稀釋液，Western二抗稀釋液（碧云天）；鼠抗β-actin，兔抗多克隆PPARα（H-98）抗體sc-9000，兔抗多克隆PPARβ（H-74）抗體sc-7197，兔抗多克隆PPARγ（H-100）抗體sc-7196（Santa Cruz Biotechnology公司）；其他化學試劑均為國產分析純試劑。

澤瀉化合物1～14，分別為澤瀉醇A（1）、24-乙酰澤瀉醇A（2）、澤瀉醇B（3）、23-乙酰澤瀉醇B（4）、澤瀉醇C（5）、23-乙酰澤瀉醇C（6）、澤瀉醇F（7）、24-乙酰澤瀉醇F（8）、澤瀉醇G（9）、澤瀉醇L（10）、11-去氧澤瀉醇B（11）、13，17-環氧-24-乙酰澤瀉醇A（12）、16-羰基澤瀉醇A（13）、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A（14）及澤瀉三萜提取物（15）（均由本實驗室分離制備^[8-11]，其中三萜提取物按照前期研究工藝對澤瀉總三萜部位進行富集純化后所得的部位^[12]），化學結構見圖1；羅格列酮、非諾貝特及L165041（美國Sigma公司）。

2 方法與結果

2.1 pBind-PPARs-LBD表達質粒的構建及鑒定

本實驗選擇使用pBind（含有酵母GAL4 DNA結合結構域且帶有Flag標簽）質粒作為載體^[12]，結構見圖2。采用Trizol法提取293T，HeLa和HuH7細胞總混合RNA，利用Premier 5.0軟件設計PPARs PCR引物，見表1，通過RT-PCR從293T，HeLa和HuH7細胞RNA克隆PPARα-LBD cDNA，PPARβ-LBD cDNA和PPARγ-LBD cDNA序列，PCR反應產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，膠回收目的條帶，將載體pBind和目的基因PPARs-LBD PCR產物進行酶切，回收、純化酶切產物，再將PPARs-LBD連接至pBind Gal-DBD形成新的功能質粒pBind-PPARs-LBD，并轉化至DH5α感受態大腸桿菌中，挑取單克隆，菌落PCR驗證后用LB液體培養基擴大培養菌落，按照Promega質粒提取試劑盒操作抽提重組質粒陽性克隆，參考PPARs-LBD和pBind的序列，采用KpnI和XhoI對構建的表達質粒進行雙酶切鑒定，pBind-PPARs-LBD鑒定結果見圖3，顯示的電泳條帶位置與核酸相對分子質量標準Marker比較，發現在1 000 bp左右有與目的相對分子質量大?。?63 bp）位置相當的條帶，酶切產物的另一條特異帶在5 000～7 000 bp，應為載體的一部分，重組質粒經雙酶切電泳驗證后送廈門欣基生物科技有限公司進行測序鑒定，測序結果通過NCBI Blast比對，詢問序列和目標序列完全匹配，同源性100%，表明表達質粒構建成功，可用于下一步的轉染實驗和報告基因的檢測。

2.2 pGL4.35報告質粒

pGL4.35質粒結構見圖2，質粒購買自美國普洛麥格（Promega）公司。

2.3 PPARs表達質粒細胞轉染及其表達驗證

2.3.1 細胞培養 293T細胞在37 ℃，5% CO₂，飽和濕度的培養箱中用含10%胎牛血清、100 U·mL^-1青霉素、100 mg·L^-1鏈霉素的DMEM培養基培養，每3～4 d以0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

2.3.2 PPARs質粒轉染細胞及其載體表達檢測 ①接種細胞，轉染前5～8 h將293T細胞以每孔細胞密度1×104個/mL接種至6孔板中，每孔2 mL，培養至細胞融合率達70%～90%取出；②將4 μg的pBind-PPARs-LBD質粒和2 μg的pGL4.35報告質粒加至150 μL的無血清DMEM培養基中，并向其中加入6 μL的PLUSTM Reagent混勻。PLUSTM Reagent與DNA的比例為1∶1（L∶g）；③將15 μL的Lipofectamine LTXReagent加至另外150 μL的無血清DMEM培養基中，輕輕混勻，Lipofectamine LTXReagent與DNA的比例為2.5∶1（L∶g）；④將②DNA懸液和③Lipofectamine LTXReagent懸液混合，總體積300 μL，輕輕混勻，室溫靜置5 min；⑤將④DNA和Lipofectamine LTXReagent混合液加至6孔板中，前后左右晃動孔板混勻，置于培養箱中培養，由于是帶血清轉染，中途無需對細胞進行換液；⑥轉染細胞24 h后，0.25%胰酶消化細胞，然后鋪24孔板，6孔板一個孔的細胞鋪一個24孔板，每孔500 μL培養基，此時同時加入藥物，前后左右晃動孔板混勻，置于培養箱中培養，繼續培養24 h。

通過Realtime PCR和Western blot法檢測細胞PPARs-LBD的表達。Realtime PCR檢測PPARs-LBD mRNA的表達結果見圖4，與空白對照相比，重組質粒pBind-PPARs-LBD轉染的293T細胞PPARs-LBD具有明顯的表達。Western blot結果見圖5，表明獲得目的條帶，含有重組質粒pBind-PPARs-LBD和報告基因pGL4.35的293T細胞PPARs-LBD蛋白有明顯的表達，說明構建的PPARs表達質?？梢栽诩毎姓１磉_，可以用于進一步的表達篩選檢測。

2.4 澤瀉PPARs活性成分篩選

2.4.1 藥物配制 澤瀉單體化合物1～14、澤瀉三萜提取物（15）和陽性藥物（非諾貝特、L165041和羅格列酮）分別以DMSO為溶劑配制成一定濃度的母液，保存于-20 ℃的冰箱中，使用前用細胞培養液稀釋成需要的濃度[澤瀉化合物1～14質量濃度均為10 mg·L^-1，澤瀉三萜提取物（15）質量濃度為50 mg·L^-1，陽性藥物質量濃度均為0.5 mg·L^-1]，保證96孔板中每孔DMSO的含量小于0.1%。

2.4.2 MTT法評價給藥濃度安全性 以每孔細胞密度1×104個/mL接種293T細胞到96孔板，待細胞融合率達70%～90%時，分別加入用培養基配制的澤瀉單體化合物（1～14）、澤瀉三萜提取物（15）及陽性藥物（0.5 mg·L^-1）干預24 h（加入的藥物均控制每孔DMSO含量<0.1%），避光條件下，每孔加入0.5 g·mL^-1MTT的PBS溶液，使MTT終濃度達0.5 g·L^-1，37 ℃孵育4 h，棄去培養液，每孔加入100 μL DMSO，低速振蕩10 min，在酶標儀490 nm波長處測定其吸光度，計算細胞活力，結果表明受試藥物在實驗相應濃度下對細胞增殖無影響。

2.4.3 加藥 轉染細胞24 h后，0.25%胰酶消化細胞，然后鋪24孔板，6孔板一個孔的細胞鋪一個24孔板，每孔500 μL培養基，澤瀉化合物1～14加藥質量濃度均為10 mg·L^-1，澤瀉三萜提取物（15）加藥質量濃度為50 mg·L^-1，陽性藥物加藥質量濃度均為0.5 mg·L^-1，加藥后前后左右晃動孔板混勻，置于培養箱中培養，繼續培養24 h。

2.4.4 熒光素酶活性的檢測 細胞培養24 h后，拿出培養箱，棄去培養基，每孔細胞用1 mL 1× PBS緩沖液洗一遍，吸盡PBS緩沖液，每孔加入100 μL1×passive Lysis buffer，室溫搖床晃動裂解15 min，將裂解液轉移到1.5 mL EP管中，12 000 r·min^-1，4 ℃離心5 min，使用GloMax 20/20單管光度計測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達：a.取10 μL裂解液置于Axygen的EP管中，向其中加入10 μL的LARII（Firefly），測定螢火蟲熒光；b.測定完成后，再向其中加入10 μL 1×Stop &Glo Reagent測定海腎熒光（Renilla）。記錄不同實驗組firefly熒光素酶表達量對renilla熒光素酶表達量的比值，然后將各藥物處理組的值對陰性對照孔的值進行歸一化處理，拿得到的新的比值進行作圖統計。

澤瀉受試藥物5，6，7，8，13，14，15能激活PPARα，受試藥物5，7，15能激活PPARβ，受試藥物6，7，8，12，15能激活PPARγ，其中化合物12對PPARγ激活能力最顯著，見圖6。

3 討論

PPAR篩選模型的構建已有文獻[7，13-14]報道，多數文獻構建了其中1種或者2種，主要篩選集中于PPARγ和PPARα^[5]，并且用于評價降脂降糖候選活性成分。近年來，隨著PPARβ研究的深入，發現其與糖脂紊亂和心血管疾病也存在密切聯系，也是降脂降糖功效靶點之一^[15]，因此，在前人研究的基礎上，通過將能被PPARα，PPARβ或PPARγ配體激活并誘導熒光素酶基因表達的重組質粒（pBind-PPARα/β/γ-LBD），分別轉入293T細胞中，并分別以PPARs特異性或選擇性激動劑（非諾貝特，L165041，羅格列酮）作為檢驗標準，構建相應的模型，研究澤瀉中15種活性成分對PPARα/β/γ是否具有激活作用。

同時，本研究PPARs激活作用的檢測采用雙熒光檢測法，pBIND質粒是一種包含了酵母Gal4的DNA結合區（Gal4-DBD）和糖皮質受體配體結合區（GR-LBD）的載體，當其被配體激活時，可誘導包含有Gal4上游激活序列的基因轉錄表達。本研究正是利用此機制，在GR-LBD區構建一種帶有PPARα/β/γ-LBD的嵌合性質粒，這種質粒是由酵母的反作用子Gal4-DBD（DNA結合區）和PPARα/β/γ-LBD（配體結合區）組成，選擇的報告基因則是含有Gal4的特異性相應原件的并帶有螢火蟲酶素基因（Firefly）的質粒，pGL4.35為pBIND的配套報告基因。當PPARα/β/γ-LBD被測試藥物激活后，就能誘導報告基因pGL4.35表達并產生熒光酶素，通過測定熒光酶素表達含量的高低，來確定測試藥物對PPARs的激活能力。其中renilla熒光素酶和PPARs-LBD在同一個載體上表達，renilla熒光素酶的表達作為內對照反映目標基因PPARs-LBD的表達，用來排除Firefly熒光素酶表達量高不是因為轉染了更多的PPARs-LBD表達質粒造成，因此將各藥物處理組的firefly與renilla比值（熒光素酶活性）對陰性對照孔的firefly與renilla比值進行歸一化處理，將得到的新的比值進行活性統計^[14]。

在本研究中，首先根據重組質粒pBind-PPARs-LBD及報告質粒pGL4.35的鑒定結果對其進行驗證，鑒定結果為陽性，則采用該功能質粒和報告基因轉染293T細胞。之后，通過Realtime PCR和Western Blot檢測細胞模型PPARs-LBD的表達，結果表明重組質粒pBind-PPARs-LBD轉染的293T細胞PPARs-LBD有明顯的表達，確定細胞篩選模型構建成功。另外，通過MTT實驗檢測14種澤瀉活性成分及3種陽性藥物在一定濃度下均沒有明顯抑制293T細胞的增殖。最后，通過檢測藥物處理后細胞篩選模型的熒光素酶活力來測定澤瀉中分離制備的化合物對PPARs的激活作用。

澤瀉PPARs活性篩選初步結果表明，化合物5，6，7，8，13，14能激活PPARα，構效分析可知激活PPARα的活性成分均具有的C16位的氧化取代，同時C11位羥基取代骨架結構；化合物5，7能激活PPARβ，兩者均為無乙?；〈哂蠧16位的氧化取代及同時C11位羥基取代的骨架結構；化合物6，7，8，12能激活PPARγ，其中化合物12對PPARγ激活能力最為顯著，可能與其獨特的13，17環氧取代有關，并通過進一步配制系列不同質量濃度（1，2.5，5，7.5，10，15 mg·L^-1）分別檢測其激活PPARγ活力，計算EC50為（6.94±0.84）mg·L^-1 [陽性藥羅格列酮EC50為（0.32±0.08） mg·L^-1]。同時本實驗發現澤瀉三萜提取物（15）具有同時激活PPARα，PPARβ和PPARγ的活性，Rau O等^[7]研究表明澤瀉乙醇提取物具有同時激活PPARα，PPARβ和PPARγ的活性，與澤瀉總三萜提取物（15）篩選的結果一致，說明三萜類化合物可能是澤瀉PPARs活性的主要藥效物質基礎。另外，本研究也發現，當澤瀉提取物給藥濃度較高時（≥75 mg·L^-1）出現PPARs活性較為明顯的下降，未能呈現良好的劑量依賴關系，可能與其產生的細胞抑制作用有關。

4 結論

本研究在配受體水平上，成功構建含有PPARs-LBD的功能質粒，將澤瀉中分離制備的14種化合物直接與PPARs受體作用，只有當PPARs被激活時，熒光蛋白酶才能有效的表達并被檢測，從而研究待測成分是否具有PPARs活性。采用該研究思路和方法，在細胞水平上成功建立一種以PPARα/β/γ為靶點的體外篩選細胞模型，以陽性藥物為對照，從澤瀉中的15種受試藥物篩選出PPARα，PPARβ或PPARγ的天然激動劑。

[致謝]中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所顏立沖博士對本課題研究中質粒構建、細胞轉染等工作提供了協助和指導。

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[責任編輯 陳玲]