高山石斛再生體系的建立

王一諾+黃雪彥+李磊

摘要：以高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）成熟種子為外植體，MS為基本培養基，研究植物生長調節素對高山石斛組織培養過程中繼代增殖和生根的影響。結果表明，高山石斛最佳的啟動培養基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L；繼代增殖中，6-BA、NAA、KT等激素的配合使用具有較好的效果，利于繼代增殖的培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L；最佳的生根壯苗培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%，此時苗的根系長而粗壯，芽苗葉色翠綠，平均根長2.79 cm，生根率達到92%。

關鍵詞：高山石斛；6-BA；NAA；KT；組織培養；繼代培養基；生根培養基

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0050-02

高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）產于云南南部，系蘭科石斛屬多年生草本植物，生于海拔約2 000 m的密林中樹干上，喜溫暖、潮濕環境[1]。高山石斛被譽為“四大觀賞洋花”之一，具有極高的觀賞價值，花期為每年的8—11月，其總狀花序來自具葉的頂端，具1～2朵花，花姿優雅，氣味芳香，既可做切花，可用于插花和餐桌的布置[2]，也可做盆栽。自然條件下，石斛屬植物的種子細小，不具胚乳，繁殖能力極低，主要通過分株方式繁殖[3]，而這種繁殖方法周期長，短時間內得到的有效苗數少。高山石斛的培植推廣受到種苗生產的制約[4]。近年來，隨著市場需求量的日益增大，原本自然資源稀缺，加之人們盲目過度采挖，使高山石斛的野生資源受到嚴重破壞[5]。本試驗以MS為基本培養基，通過不同植物生長調節劑的配比應用，對高山石斛進行組織培養技術研究，篩選出高山石斛各個生長培養階段的優勢培養基，加快其繁殖速度，以期使高山石斛野生資源得到有效保護，同時降低組培成本，為高山石斛大規模的組培苗生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

高山石斛未開裂成熟蒴果，采自廣西壯族自治區藥用植物園科研基地內健壯、無病害的植株上。

1.2 組織培養

1.2.1 外植體消毒與啟動培養 將高山石斛成熟飽滿、未開裂的蒴果用流水清洗表面污垢，置于燒杯中依次用2%洗潔精溶液浸泡5 min，用線狀的自流水沖洗15 min；移至超凈工作臺，用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗2次；用添加2滴吐溫-20的0.1% HgCl2浸泡15 min，無菌水浸泡沖洗3次；用消毒的濾紙除去表面水分，用無菌解剖刀將高山石斛蒴果的果皮輕輕切開，用無菌鑷子將胚均勻撒播在以MS為基本培養基、添加不同濃度植物生長劑（6-BA、NAA）的啟動培養基上，觀察接入外植體的變化。

1.2.2 繼代增殖 將經過初代培養獲得的無菌芽切為獨立的單芽，接種于以MS為基本培養基，添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L 瓊脂、1 g/L活性炭、不同濃度植物生長調節劑（1.0～4.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L NAA、0～0.5 mg/L KT）的繼代增殖培養基上培養，pH值為5.8。重復3次。

1.2.3 生根培養 將繼代增殖培養生長至3 cm左右的健壯單株從叢芽中剝離，接種至添加不同濃度植物生長調節劑（6-BA、NAA）和植物提取液的MS基本培養基上進行壯苗生根培養60 d，pH值為5.8；調查統計高山石斛生根的情況。每種培養基接種50株。

1.3 組織培養條件

溫度24～28 ℃，光照時間為12 d/h，平均光照為1 500～2 200 lx。

1.4 煉苗移栽

挑取生長健壯、根系發達的高山石斛組培苗移入大棚溫室內，打開瓶蓋放置7 d，期間往瓶內組培苗噴灑少量水，保持瓶內水分充足；將瓶內幼苗取出，流水沖洗干凈根部的培養基，避免損傷根部的幼嫩組織；將幼苗于傍晚移栽至經消毒過的栽培基質中，保持濕度，上部覆蓋1層遮陽網適度遮陰。

2 結果與分析

2.1 種子的萌發情況

種子接入誘導培養基培養25 d，大部分種子都固著在培養基表面，可明顯地觀察到種子胚開始變大，由淡黃色慢慢變成淡綠色；隨培養時間的增加，淡綠色轉變為深綠，萌發為原球莖；培養60 d，膨大的原球莖頂端產生葉原基突起，原球莖開始慢慢分化，出現芽尖，并逐漸長成芽苗。由表1可見，6-BA、NAA都對高山石斛芽的誘導產生影響；6-BA濃度不變時，NAA濃度增大有利于芽的萌發；NAA濃度不變時，6-BA 在0.1～0.5 mg/L范圍內，濃度過高反而會使芽的萌發率下降；在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養基上，高山石斛種子的萌發個數相對最多，芽苗顏色濃綠，長勢良好（圖1）。因此，MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L為最佳誘導培養基。

2.2 繼代增殖

由表2可見，以MS為基本培養基、添加不同激素的12種培養基中，無菌芽苗接入增殖培養基30 d開始分化，芽的增殖倍數有明顯差異；NAA、KT保持濃度不變，6-BA濃度為3.0 mg/L時芽的增殖能力相對較強，芽的增殖倍數為3.7～4.6（培養基編號為B7～B9），隨著6-BA濃度增加，芽的增殖倍數有所下降，且苗生長過快，莖較細弱，有效苗的質量變差；6-BA、NAA保持濃度不變時，培養基中加入KT有利于苗的增殖；培養基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L芽的增殖能力最強，增殖倍數達到4.6，芽生長情況良好，苗健壯，葉色翠綠（圖2）。因此，確定培養基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L為高山石斛芽苗的最適增殖培養基。

2.3 生根培養

由表3可見，高山石斛在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%的培養基上生根率和生根數分別為92%、46條，平均根長達2.79 cm，且芽苗葉色翠綠，植株健壯，根系長而粗壯，主次分明（圖3），優于其他組合；6-BA濃度保持不變時，隨NAA濃度的增大，高山石斛芽苗的生根率提高、生根數有所增加，NAA濃度為2.0 mg/L時生根效果相對最好，濃度過高反而不利于根的生長。

2.4 煉苗移栽

試驗表明，煉苗基質以木屑 ∶草炭=2 ∶1為宜，栽好幼苗再覆蓋1層苔蘚，澆透水定根，同時保持棚內濕度85%左右、溫度為20～30 ℃，15 d左右長出新根去掉遮陽網，此時，幼苗成活率高，生長健壯。

3 結論與討論

組織培養過程中，只有植物生長調節劑配比恰當，才有利于組培苗的生長、 分化和快速繁殖[6]。MS培養基適合于大多

數的雙子葉植物，但不同品種在種子萌發和增殖過程中需要的激素濃度有很大區別[7]。本試驗中，MS基本培養基中加入適宜的6-BA、NAA，可促進高山石斛種子的萌發，較適宜種子萌發的培養基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L，NAA濃度不變時，6-BA濃度過高反而會抑制萌發。

幼苗增殖和分化是組織培養過程中繁殖速度和增殖系數的關鍵[8]，而組培苗的增殖系數很大程度上受細胞分裂素的影響。試驗表明，隨6-BA濃度的增大，繁殖系數有所提高，但當6-BA濃度達到4.0 mg/L時，繁殖系數反而有所降低。KT作為外源性細胞分裂素，可以促進側芽發育[9]。在高山石斛繼代增殖過程中，6-BA、NAA、KT等激素的聯合使用，對芽苗的增殖起到較為理想的效果，高山石斛在培養基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭 1.0 g/L 中的繼代增殖效果相對最佳，芽生長情況良好，苗健壯，葉色翠綠，增殖倍數達到4.6，且得到的有效苗數最多。

植物生長調節劑NAA對高山石斛的壯苗生根起到重要作用，與植物提取液香蕉汁配合使用生根效果較好，培養出的種苗植株健壯，主根系長而粗壯，成活率高。因此，最適宜壯苗生根的培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%。

高山石斛喜溫暖、潮濕的環境，移栽時關鍵是選取合適的栽培基質。以木屑 ∶草炭灰=2 ∶1作為栽培基質，并覆蓋1層苔蘚，既疏松又保水透氣，是一種較好的栽培基質。

參考文獻：

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