傳染性造血器官壞死病毒焦磷酸測序檢測技術的建立

尹偉力，劉 瑤，倪楊帆，張四化，岳志芹，孫 濤

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2.榮成出入境檢驗檢疫局，山東榮成 264300；3.武漢市農業檢測中心，湖北武漢 430003；4.武漢市動物疫病預防控制中心，湖北武漢 430003；5.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東青島 266000)

傳染性造血器官壞死病毒焦磷酸測序檢測技術的建立

尹偉力1，劉 瑤2，倪楊帆3，張四化4，岳志芹5，孫 濤5

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2.榮成出入境檢驗檢疫局，山東榮成 264300；3.武漢市農業檢測中心，湖北武漢 430003；4.武漢市動物疫病預防控制中心，湖北武漢 430003；5.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東青島 266000)

根據傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)基因序列，設計了IHNV最為保守的指紋序列，以及測序引物，建立了IHNV焦磷酸測序檢測方法。對所構建的IHNV焦磷酸檢測方法進行特異性試驗和靈敏度檢測。結果表明，所建立的方法特異性好，在8種魚類病毒中能夠特異性檢測出目的病毒，檢測方法靈敏度高，最低檢出核酸量為10 pg/μL。對建立的焦磷酸測序檢測方法進行了實際應用研究，選取國內采集與進口的魚類樣本共計80批次進行IHNV檢測。結果顯示，焦磷酸測序檢測方法可以有效的檢出常規RT-PCR不能檢出的假陰性樣本和弱陽性樣本，該方法的靈敏度和特異性可以滿足水生動物疫病檢測的需要。

傳染性造血器官壞死病毒；焦磷酸測序；檢測

傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)是一種能引起魚類急性全身性疾病而造成高死亡率的病毒，尤其會感染野生鮭魚及養殖鮭魚的幼苗[1-3]。1953年在美國華盛頓一家水產養殖孵化場的死亡虹鱒魚發現該病毒[4-5]。在接下來的幾十年里，該病在加利福尼亞大鱗鮭魚孵化場出現類似的暴發。起初專家認為IHNV僅限于在美國西北太平洋鮭科魚類流行[6]。然而，該病毒在20世紀70年代蔓延到歐洲、日本、美國、韓國、中國大陸和中國臺灣地區，主要通過船運感染IHNV的魚和卵來傳播[7-8]。

IHNV是影響世界魚類養殖業的主要病害，如何控制好疫病的暴發，做好病害防控，成為目前我國水產養殖業和進出口行業的重要工作。參照世界動物衛生組織(OIE)《水生動物疫病診斷手冊》[9]及我國的出入境檢驗檢疫行業標準[10]，細胞培養分離與RT-PCR是目前普遍采用且有效的2種檢測方法。細胞培養分離操作復雜，需要盲傳2代，檢測周期長，而RT-PCR必須與測序聯合使用才能作為疫病確診的依據。RT-PCR作為一種常規的核酸檢測方法，其操作需要經歷核酸提取、核酸擴增、瓊脂糖電泳、擴增產物回收以及擴增產物測序5個階段，全程耗時3個～5個工作日，耗時較長。如果PCR擴增產物濃度低而不能達到測序要求時，測序將無法進行，進而不能對檢測到的疑似陽性樣品進行最終確診。

在實際檢測工作中，需要建立一種對病原體一段很短但是特別保守的片段進行測序方法，這種方法要求快速簡潔并滿足對病原體大量檢測的需要。因焦磷酸測序檢測方法能夠短時間內精準測出短DNA片段的序列，同時可以測96份樣品[11-12]，操作簡便，能夠形成標準化的檢測流程，特別適合水生動物疫病病原體的檢測與確證。本研究以IHNV為研究對象，設計特異的測序引物及其指紋序列，優化焦磷酸測序條件，建立特異、準確的IHNV焦磷酸測序檢測技術體系，為水生動物病毒病害的監測和防控提供新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株核酸 傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、病毒性神經壞死病毒(VNNV)和錦鯉皰疹病毒(KHV)核酸，華中農業大學提供。鯉春病毒株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與設備 引物、檢測探針，寶生物工程(大連)有限公司合成；生物素標記通用引物，上海英俊Invitrogen公司合成；dNTP、ExTaqDNA聚合酶混液、One step RT-PCR試劑盒、DNA標準DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產品；Qiagen DNA提取試劑盒(52906)、Qiagen RNA提取試劑盒(74104)，Qiagen公司產品；Pyro SQA Reagents DNA序列分析試劑盒(96次)、鏈霉親和素包被磁珠，北京基因有限公司產品。

Qiagen PYROMARKID焦磷酸測序儀；PCR擴增儀，Eppendorf公司產品；電泳儀(DYY-8C)，北京六一廠產品；凝膠成像儀(G-BOX-EF)，天能公司產品；紫外燈觀察箱(Icm-26)，上海路陽公司產品。

1.2 方法

1.2.1 測序指紋序列的確定及測序引物設計 選取IHNV較為保守的N基因作為研究對象。登錄美國國立生物信息技術中心(NCBI)，查詢檢索已公開的IHNV N基因。去除一些信息不全、不完整的序列片段，對來自同一地點、同一年份、序列差異極小的毒株，選取其中1株，最后選取的序列號如下： IHNV N基因序列，登錄號分別為FJ265710.1、FJ265711.1、FJ265712.1、FJ265713.1、FJ265714.1、FJ265715.1、X89213.1。

用DNA Star 7.1軟件中附帶的Editseq和MegAlign功能，上面找到的序列輸入至軟件中，每個堿基進行比對。找到IHNV最為保守的20 bp以內的一段序列，作為焦磷酸測序的指紋序列。在指紋序列上、下游設計測序引物。

1.2.2 測序引物RT-PCR反應 按照Qiagen RNA提取試劑盒說明書提取組織樣品或病毒液的RNA。

取2 μL IHNV核酸，按照RT-PCR試劑盒說明配置反應體系，加入上游測序引物0.5 μL，標記生物素下游測序引物0.5 μL，DEPC水補足體積至50 μL。PCR儀設定如下程序：50℃ 30 min；94℃ 5 min，94℃ 30 s，摸索測序引物的退火溫度，72℃ 30 s，共30個循環；最后72℃延伸10 min，4℃結束反應。

取10 μL RT-PCR產物和1 μL加6×Loadingbuffer混合，在10 g/L瓊脂糖凝膠上以5 V/cm電壓電泳，以標準分子質量作參考，觀察是否擴增成功。

1.2.3 焦磷酸測序反應 取50 μL用標記生物素的測序引物擴增的PCR產物，加入200 μg包被了鏈酶親和素的磁珠，室溫孵育20 min，讓磁珠與PCR產物連接。用測序儀自帶的真空泵工具將連接磁珠的PCR產物吸起，然后用700 mL/L酒精清洗5 s；放入denatureation buffer清洗5 s；用Washing buffer清洗10 s；用真空泵工具將PCR磁珠產物放入反應板中，加入測序引物2 μL，輕輕振搖，釋放磁珠。將待測物放入80℃烘箱2 min，放置室溫冷卻。

將待測物放入焦磷酸測序儀中反應，溫度設置為28℃。每次進樣的壓力選擇600 mbar，進樣時間設置為8 ms，每輪測序時間設置為65 s。測序引物沿著待測模板，隨著不同dNTP的加入而擴增。每當有單個dNTP結合，反應會釋放信號，測序儀收集信號，生成測序峰。

1.2.4 特異性試驗 將IHNV的測序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia,VHSV)、流行性造血器官壞死病毒(Epizootic haematopietic necrosis virus,EHNV)、傳染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)、牙鲆彈狀病毒(Hirame rhabdovirus,HRV)、病毒性神經壞死病毒(Viral nervous necrosis virus,VNNV)、鯉春病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)和錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的RNA模板進行RT-PCR擴增，將RT-PCR產物進行焦磷酸測序分析。

1.2.5 靈敏度試驗 將IHNV核酸進行10倍倍比稀釋后，采用建立的焦磷酸測序方法進行檢測，并檢測其靈敏度。

1.2.6 樣本的檢測 2013年—2015年，采集我國國內養殖的魚類樣品共計50批次，進口魚樣共計30批次，每批次采集魚樣本至少30尾，魚品種為大磷大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大西洋鮭魚(Salmosalar)，樣品為魚苗、幼魚或成魚。取魚樣本的腎、脾、肝、眼、腦等器官。對于魚苗，取整只魚做為樣品，將組織勻漿，提取RNA，進行IHNV焦磷酸測序檢測。

取樣本核酸，進行IHNV的常規RT-PCR檢測，檢測引物參考OIE《水生動物疫病診斷手冊》(2015版)[9]，將這兩種檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 測序指紋序列的確定及測序引物設計

IHNV N基因序列比對后，發現包含558-571位點的核苷酸序列“GGACAGAAGCTCA”高度保守，將其作為標準指紋序列(圖1)。根據IHNV的指紋序列，設計測序引物(圖2,表1)。

2.2 測序引物的RT-PCR擴增

通過對PCR的變性、退火、延伸溫度和時間的優化，最后確定測序引物RT-PCR的循環條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s， 54℃ 30s，72℃ 30 s，共循環30次；72℃ 10 min，4℃結束反應。用所建立的IHNV測序引物RT-PCR擴增IHNV核酸，檢測結果均擴增出預期的目的條帶(61 bp,圖3)。

圖1 IHNV的指紋序列

圖2 IHNV N基因引物設計結果

表1 引物設計

2.3 焦磷酸測序結果

IHNV的RT-PCR產物，經焦磷酸測序反應，所測序列為“GGACAGAAGCTCA”(圖4)，與預期的指紋序列一致。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照；2,3.IHNV

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2,3.IHNV

圖3 電泳結果

Fig.3 The electrophoretic results

圖4 IHNV測序結果

2.4 特異性試驗結果

將IHNV的特異性測序引物分別與VHSV、EHNV、IPNV、HRV、VNNV、SVCV和KHV的RNA模板進行 RT-PCR擴增及焦磷酸測序，只有與特異性引物相吻合的IHNV RNA模板得到預期擴增片段大小(61 bp，圖5)及相應峰型，其余病毒均未得到特異性條帶及和已知序列吻合的峰型，由此鑒定了引物設計的特異性。

2.5 靈敏度試驗結果

將IHNV核酸進行10倍倍比稀釋后采用該焦磷酸測序方法檢測，結果發現，隨著核酸濃度的降低，測序結果隨之減少。該方法對IHNV核酸的最低檢出量達到 10 pg/μL(圖6)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.IHNV；2.SVCV；3.VHSV；4.EHNV；5.HRV；6.IPNV；7.VNNV；8.KHV；9.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.IHNV;2.SVCV;3.VHSV;4.EHNV;5.HRV;6.IPNV;7.VNNV;8.KHV;9.Negative contol

圖5 IHNV焦磷酸測序特異性試驗結果

Fig.5 The specificity results of the pyrosequencing for IHNV

M.DNA 標準DL 2 000;1.10 ng/μL；2.1 ng/μL； 3.100 pg/μL；4.10 pg/μL；5.1 pg/μL；6.100 fg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.10 ng/μL；2.1 ng/μL；3.100 pg/μL；4.10 pg/μL；5.1 pg/μL；6.100 fg/μL

圖6 IHNV 焦磷酸測序靈敏度試驗結果

Fig.6 The sensitivity analysis of the pyrosequencing for IHNV

2.6 樣品的檢測

IHNV陽性檢出樣品數量：焦磷酸測序檢測與常規RT-PCR檢測結果相同，共計14批陽性，常規RT-PCR 12批陽性，其中弱陽性2批。除1批RT-PCR弱陽性樣品外，其余RT-PCR檢出陽性樣品均經測序確證為IHNV陽性。陽性檢出樣品涉及3種被采樣魚品種(表2)。

3 討論

本研究建立了傳染性造血器官壞死病毒的焦磷酸檢測方法，并對其進行了反應條件的優化。該方法為國內外首次建立IHNV焦磷酸檢測技術。

OIE對于IHNV推薦的檢測方法為病毒分離與RT-PCR。病毒分離需要建立合適的水生動物細胞系，即使有已經構建好的細胞系，還需要對細胞進行傳代、凍存等操作。在進行病毒分離時，需要將樣品溶液進行倍比稀釋，每個稀釋度接種細胞，觀察7d為1代。如果這一代細胞沒有出現CPE,則需要盲傳第2代，還需觀察7 d。病毒分離方法總計需要14 d左右，操作繁瑣，周期較長，不適合口岸對大量進出境水生動物快速檢疫的需求。

表2 IHNV焦磷酸測序檢測方法與常規RT-PCR檢測結果

續表2

編號№采樣地點/Samplingposition樣品名稱/Name檢測結果/Results焦磷酸測序PyrosequencingRT-PCR編號№采樣地點/Samplingposition樣品名稱/Name檢測結果/Results焦磷酸測序PyrosequencingRT-PCR39廣州Guangzhou虹鱒Oncorhynchusmykiss--60挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--40廣州Guangzhou虹鱒Oncorhynchusmykiss--61俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--41廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--62俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--42廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--63俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--43廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--64俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--44廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--65俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--45廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss++66俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--46廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss+-67俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--47廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--68俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--48廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--69俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--49廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--70俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--50廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--71加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss+-51挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar++(弱陽)72加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--52挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--73加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++53挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--74加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++54挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--75加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--55挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--76加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--56挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--77加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--57挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar++78加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++58挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--79加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++59挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--80加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++

對于RT-PCR來說，由于靈敏度有限及其引物在擴增時可能產生的錯配導致的非特異性結合，檢測結果會存在假陽性、假陰性和非特異性擴增，為保證結果的準確性，OIE和我國出入境檢驗檢疫行業標準明確規定需要對PCR產物進行測序。測序需要送到專門的生物技術公司，檢測周期較長。本研究建立的焦磷酸方法耗時短，一般3 h～4 h就可以出結果，并且以具體序列為檢測結果，這杜絕了假陽性的出現。本研究利用建立的IHNV焦磷酸檢測方法對我國國內養殖魚與進口魚80份樣本進行檢測，涉及大磷大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大西洋鮭魚(Salmosalar)等多個品種，進行了IHNV的檢測，大菱鲆曾經在我國出口魚類養殖業中占據重要地位，而虹鱒是近些年常有疫病檢出的主要宿主魚。將檢測結果與OIE推薦的常規RT-PCR相比較，結果可以看出，焦磷酸法對于常規RT-PCR的弱陽性樣品樣本有明顯的檢出，且檢測結果PCR完全一致，因而可以有效的證明，焦磷酸方法的高靈敏度是有效的，避免了假陽性檢出。而常規PCR檢測檢出的弱陽性樣品，由于不能滿足測序對樣本濃度的要求，因而不能進行有效測序，參照OIE《水生動物疫病診斷手冊》和我國檢驗檢疫行業標準，由于不能進行有效測序，因而不能作為疫病陽性檢出確診的依據。焦磷酸測序方法的核心是設計特異性的測序引物與指紋序列。據文獻所述[13]，焦磷酸測序時，測序引物5′末端特異性無嚴格要求，而3′段需要與目的核酸序列完全互補。本研究所設計的測序引物的5′末端與3′末端DNA熔解溫度(Tm)值一致，因而引物兩端可以同時與模板結合，具有一致性，有利于提高檢測的準確率。指紋序列的設計需要通過比對病毒各個基因的序列，選擇最為保守的一段序列。因為焦磷酸測序技術不能測過長的片段，指紋序列應該選擇20 bp以內的長度。

焦磷酸測序技術結合PCR的靈敏度和DNA測序技術的精確度兩方面的優勢，測序引物與指紋序列高度保守的情況下，對一段短序列進行測序，檢測結果直觀可見，操作簡便，檢測周期短，易于推廣應用。

[1] Alonso M,Stein D A,Thomann E,et al.Inhibition of infectious haematopoietic necrosis virus in cell cultures with peptide-conjugated morpholino oligomers[J].J Fish Dis,2005,12:287-291.

[2] Fregeneda Grandes J M,Skall H F,Olesen N J.Antibody response of rainbow trout with single or double infections involving viral haemorrhagic septicaemia virus and infectious haematopoietic necrosis virus[J].Dis Aqua Organ,2009,12:831-840.

[3] Granzow H,Weiland F,Fichtner D.Enzmann. Studies of the ultrastructure and morphogenesis of fish pathogenic viruses grown in cell culture[J].Jf Fish Dis,2003,22:201-206.

[4] Gunimaladevi I,Kono T,Lapatra S E,et al.A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J].Arch Virol,2005,9:1505-1510.

[5] Hansen J D,PatraS L.Induction of the rainbow trout MHC class I pathway during acute IHNV infection[J].Immunogenetics,2002,44:549-555.

[6] Knüsel R，Bergmann S M，Einer-Jensen K,et al.Virus isolation vs RT-PCR:which method is more successful in detecting VHSV and IHNV in fish tissue sampled under field conditions[J].JFish Dis,2007,12:309-313.

[7] Purcell M K,Hart S,Alexandra K G,et al.Strand-specific, real-time RT-PCR assays for quantification of genomic and positive-sense RNAs of the fish rhabdovirus, Infectious hematopoietic necrosis virus[J].J Virol Meth,2005,54:1321-1322.

[8] Xu L M,Liu H B,Yin J S,et al.Prokaryotic expression and immunogenicity analysis of glycoprotein from infectious hematopoietic necrosis virus[J].Chine J Virol,2014,23:295-299.

[9] Office International Des Epizooties.Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals[EB/OL].[2016-6-18]http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/

[10] 賈 鵬,何俊強,楊俊興,等.SN/T 1474-2014 傳染性造血器官壞死病檢疫技術規范[S].北京:中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,2014.

[11] Gruber J D,Colligan P B,Wolford J K.Estimation of single nucleotide polymorphism allele frequency in DNA pools by using Pyrosequencing[J].Hum Genet,2002,110(5):395-401.

[12] Nordstrom T,Ronaghi M,Forsberg L.Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by pyrosequencing[J].Biotechnol Appl Biochem,2000,31(Pt2):107-112.

[13] Ronaghi M.Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing[J].Genome Res，2001,11(1):3-11.

Development of Pyrosequencing Method for Detecting Infectious Hematopoietic Necrosis Virus

YIN Wei-li1,LIU Yao2，NI Yang-fan2， ZHANG Si-hua4，YUE Zhi-qin5,SUN Tao5

(1.YantaiEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Yantai,Shandong,264000,China;2.RongchengEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Rongcheng,Shandong,264300,China;3.WuhanTestingCenterForAgriculture,Wuhan,Hubei,430003,China;4.WuhanCenterForAnimalDiseaseControlandPrevention,Wuhan,Hubei,430003,China;5.TechnicalCenterofShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao,Shandong,266000,China)

By collecting the sequences of IHNV,the fingerprint sequences and the sequencing primers of the viruse were designed.The pyrosequencing method for detection of IHNV was established successfully.The method has good specificity and sensitivity,and can specifically identify the objective viruses in the eight fish viruses.The method has high sensitivity and the minimum detection limit of nucleic acid is 10 pg/μL.The method was verified by the detection of IHNV in 80 batches of the samples collected from domestic and imported fishes.The results indicated that the pyrosequencing method can effectively detect the false negative and weakly positive samples,which the traditional method RT-PCR cannot detect.The specificity and sensitivity of the method met the requirement for detection of aquatic animal diseases.

Infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV);pyrosequencing;detection

2016-06-25

科技部“十二五”支撐計劃項目(2013BAD12B02)

尹偉力(1982-),男，山東煙臺人，碩士，高級獸醫師，主要從事獸醫學研究工作。

S854.43

A

1007-5038(2017)03-0043-07