古法炮制地黃與市售地黃成分的比較

楊飛飛，李勝男，郭懷忠，楊茹敏

(1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002； 2.安國市益源康中藥材有限公司，河北 安國 071200)

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古法炮制地黃與市售地黃成分的比較

楊飛飛1，李勝男1，郭懷忠1，楊茹敏2

(1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002； 2.安國市益源康中藥材有限公司，河北 安國 071200)

通過高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術來研究古法炮制生、熟地黃藥材與當前市售生、熟地黃的品質差異，為地黃藥材質量標準的完善以及炮制方法的研究提供參考.樣品采用甲醇提取，使用Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，乙腈-0.1% (體積分數) 磷酸水溶液梯度洗脫，多波長紫外檢測器檢測，流速 1.0 mL/min，進樣量 20 μL，柱溫 35 ℃.分別對生、熟地黃的HPLC指紋圖譜的共有峰面積進行比對.古法炮制地黃與市售地黃所含成分有顯著差異，古法竹刀切片制生地黃與古法酒蒸炮制熟地黃，其主要成分梓醇、毛蕊花糖苷含量普遍高于市售生、熟地黃；而5-羥甲基糠醛的含量遠低于市售品.

生地黃；熟地黃；指紋圖譜；HPLC；炮制

地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的塊根，在臨床上應用廣泛，生地黃、熟地黃是其2種入藥形式.鮮地黃緩緩烘焙至約八成干，制得生地黃；生地黃照酒燉法或蒸法炮制，即得熟地黃.生地黃性寒、味甘，歸心、肝、腎經，具有清熱涼血，養陰生津的功效.熟地黃性微溫、味甘，歸肝、腎經，具有補血滋陰，益精填髓的功效[1].生地黃炮制成熟地黃后其藥性由寒轉溫，功能由清轉補，2者在藥性、藥效上有著極大的差異.地黃的炮制方法及炮制品的質量會極大影響其臨床療效.

中藥炮制是根據中醫臨床用藥理論和藥物配制的需要，將藥材進一步加工的傳統工藝，與藥效有著密切的關系，且古法炮制中多有禁忌[2].如生地黃的炮制，《雷公炮炙論》曰，“凡使生地黃……，勿犯銅鐵器，令人腎消并發白，男損榮，女損衛也”，因此古法加工生地黃時多用木刀或竹刀切制[3].酒制熟地黃是地黃傳統制法之一，且古法記載炮制時要求達到“九蒸九曬”，方得質量上乘地黃藥材[4].現今地黃加工炮制在輔料使用及工藝上多有改變，并簡化炮制工藝，且不完全統一，且多數僅以“黑如漆，甜如飴”等籠統的性狀變化作為達到炮制終點的標準，缺少客觀的質量檢測指標.以蒸制地黃為例，基于工業化要求，目前多采用一次蒸制，蒸熟即可，但《本草綱目》中記載“今布中惟以酒煮熟售者，不可用.”《備急千金要方》中亦記載“候好晴日便早蒸之,即暴于日中,夜置汁中以物蓋之,明朝又蒸,古法九遍止,今但看汁盡色黑熟,蒸三五遍亦得”.不同的炮制過程必然會造成地黃藥材質量出現差異.相關研究表明，地黃炮制前后，其主要成分梓醇、苷類、5-羥甲基糠醛等會發生明顯的變化[5-6].本文參考文獻[7]，建立了高效液相色譜測定地黃指紋圖譜的方法，并利用該方法對采用竹刀切片制生地黃，古法多次酒蒸法制熟地黃，以及市售地黃進行研究，比較其成分差異，為開展地黃藥材炮制規范化研究提供參考.

1 材料與試劑

1.1 藥材

市售生地黃(編號：生地黃Ⅰ-Ⅶ)、熟地黃(編號：熟地黃Ⅰ-Ⅶ)分別購自7家不同的藥店.古法竹刀切片制生地黃(編號：生地黃Ⅷ-Ⅹ)、古法多次酒蒸法制熟地黃(編號：熟地黃Ⅷ-Ⅹ，自制)各3批.古法炮制生、熟地黃樣品均由安國市益源康中藥材有限公司提供，所有藥材均經河北大學藥學院徐宏欣老師鑒定為正品.

1.2 儀器與試藥

P3000高效液相色譜儀(北京創新通恒科技有限公司)；Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)；AG204電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；TG16-W微量高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；HH-601超級恒溫水浴(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司).

梓醇(批號110808-200508)和毛蕊花糖苷(批號111530-201007)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；5-羥甲基糠醛(5-HMF)為實驗室參考文獻[8-9]自制(稱取葡萄糖2.0 g，以HCl-CrCl3為復合催化體系，在溫度200 ℃下反應15 min制得，經HPLC測定無雜峰，符合定性要求)；甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司).

2 方法

2.1 古法炮制[3-4]

鮮地黃洗凈，毛刷去皮，竹刀切片，晾至八成干，制得生地黃.將適量黃酒與生地黃倒入壇中，用糯米制泥封口，燜蒸24 h，取出，曬至八成干，同上繼續蒸曬，重復3次，制得熟地黃.

2.2 樣品制備

將干燥后的各類地黃分別研磨粉碎為粗粉，即粒度范圍控制在能全部通過二號篩.精密稱取藥材粉末1.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，旋蒸濃縮至近干，殘渣用體積分數15%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，經 0.45 μm 濾膜過濾，備用.

2.3 色譜條件

Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，流速1.0 mL/min，生地黃檢測波長為210、334 nm，熟地黃檢測波長為334、284 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL.二元梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為體積分數0.1% 磷酸水溶液(洗脫程序：0～5 min，1%A；5～10 min，1%～4%A；10～22 min，4%～6%A；22～30 min，6%～18%A ；30～60 min，18%～25%A；60～80 min，25%～35%A).

2.4 精密度實驗

取同一樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，連續進樣5次，記錄保留時間及各峰峰面積.

2.5 重復性實驗

取同一藥材5份，按“2.2”項下方法操作，制備樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄保留時間及各峰峰面積.

2.6 穩定性實驗

同一樣品溶液，室溫存放，分別于0、4、8、12、24、48 h，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄保留時間及各峰峰面積.

3 結果與分析

3.1 古法炮制地黃與市售地黃性狀對比

古法竹刀制生地黃與市售生地黃，古法炮制熟地黃與市售熟地黃在性狀上均存在較大差異，對比圖如圖1.

a.竹刀制生地黃；b.市售生地黃；c.古法制熟地黃；d.市售熟地黃.

由圖1中a、b可以看出，市售生地黃呈深棕色，而竹刀切制的生地黃顏色明顯較淺.推測可能是市售生地黃接觸鐵器，使某些化學成分發生變化而使得其顏色變深.由圖中c、d可看出，2種熟地黃表面皆是烏黑色，但古法制熟地黃有光澤，并且與市售熟地黃相比黏性大，質柔軟而帶韌性，不易折斷.

3.2 色譜條件的建立及優化

210、334 nm分別是2015年版《中國藥典》規定的生、熟地黃檢測成分梓醇、毛蕊花糖苷的吸收波長[1].284 nm是5-HMF的檢測波長，它是文獻[5]報道地黃炮制前后變化最顯著的成分之一.因此，本實驗參考2015年版《中國藥典》生、熟地黃的含量測定色譜條件，并對流動相梯度程序進行優化，以獲得盡量多的共有峰信息，最終確定的色譜條件見2.3.采用多個波長進行分析，樣品間可識別的共有峰增加，能更準確地反映藥材間的差異.

3.3 方法學驗證

在精密度、重復性和穩定性實驗中，測得其共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均在1.1%和4.7%以內，表明儀器的精密度和方法重復性良好，樣品在室溫下48 h內穩定.

3.4 生地黃樣品測定

取“2.2”項下生地黃樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析.生地黃代表性HPLC指紋圖譜見圖2、3、4、5.

通過向樣品中添加對照品來確定樣品中的梓醇和毛蕊花糖苷峰.在210 nm下，生地黃共11個共有峰(圖2)，所有批次梓醇峰面積比較見圖3.由圖3可見，古法制生地黃梓醇峰面積整體高于市售生地黃.在334 nm波長下，共7個共有峰(圖4)，由圖5可看出，古法制生地黃(Ⅷ-Ⅹ)中毛蕊花糖苷峰面積皆遠遠高于其他批次藥材.利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004版A)對不同波長下的地黃HPLC指紋圖譜進行了相似度分析，發現在210 nm下，除生地黃Ⅱ外，其余批次相似度皆大于0.873；在334 nm下，除生地黃Ⅱ外，其余皆大于0.823，生地黃Ⅱ的梓醇和毛蕊花糖苷含量都很低，這可能是由于藥材本身的品質差異或炮制儲藏不當造成的.相對來說，3批古法制生地黃的相應成分含量較高.

a.生地黃Ⅰ；b.生地黃Ⅷ；1.梓醇

圖3 所有批次生地黃梓醇峰面積比較

a.生地黃Ⅰ；b.生地黃Ⅷ；2.毛蕊花糖苷

圖5 所有批次生地黃毛蕊花糖苷峰面積比較

3.5 熟地黃樣品測定

取“2.2”項下熟地黃樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析.熟地黃藥材代表性HPLC指紋圖譜見圖6、7、8、9.

334 nm下熟地黃共有峰有8個(圖6)，由圖7可知，古法制熟地黃中毛蕊花糖苷峰面積均明顯高于各批次市售熟地黃，此波長下指紋圖譜相似性皆大于0.874.在284 nm下，熟地黃指紋圖譜差異較大，共有峰少，并且其相似度較低，在0.555～0.659內，見圖8.由圖9可知，市售熟地黃的5-HMF峰面積皆遠遠高于自制熟地黃，其中熟地黃Ⅲ的峰面積甚至達到2×107.

熟地黃中的5-HMF主要來自于炮制加熱過程中單糖的脫水轉化，加熱時間和溫度對其產生量有重要影響.在較短的時間內單糖不斷脫水轉化，表現為5-HMF隨加熱時間的延長而增加[10]，但本文所制熟地黃中5-HMF含量極低，可能主要是因為本文的古法地黃炮制方式歷時較長，在長時間的蒸曬過程中，轉化相對較完全的5-HMF本身不穩定，易發生降解，并且5-HMF可隨水蒸氣揮發[11]，最終導致5-HMF含量大幅減少[12].

a.熟地黃Ⅰ；b.熟地黃Ⅷ； 2.毛蕊花糖苷

研究表明，5-HMF對眼睛、黏膜和皮膚有刺激性，能與人體蛋白質結合引起中毒，造成橫紋肌麻痹和內臟損害，并且具有神經毒性，還具有潛在的遺傳及生殖毒性[13-14].同時也有研究發現5-HMF存在一定的藥理活性，如降血糖[15]、改善學習記憶[16]、抗心肌缺血[17]等.5-HMF既有一定毒性，同時又有某些藥理活性，因此，該成分對熟地黃功效和毒副作用的綜合影響，以及對其含量控制指標的制定尚有待進一步探討.

圖7 所有批次熟地黃毛蕊花糖苷峰面積比較

a.熟地黃Ⅰ；b.熟地黃Ⅷ；3.5-HMF

3.6 鐵粉處理生地黃Ⅷ

上述結果表明，古法炮制生地黃和熟地黃中，梓醇和毛蕊花糖苷的含量明顯高于市售品，推測藥材與鐵器的接觸可能是導致這2個成分含量出現變化的主要原因，因為古法明確說明地黃的炮制“忌犯銅鐵器”而應用竹刀切制.鐵作為催化劑可催化一些化學反應，因此將竹刀切片制生地黃Ⅷ經鐵粉處理，來考察其指紋圖譜的變化.處理過程：取少量生地黃Ⅷ放入燒杯中，加入少許鐵粉和水，紙封口，放置5 h后取出，置50℃烘箱中干燥，按“2.2”項下制備樣品溶液，進行HPLC分析.HPLC指紋圖譜見圖10.

圖9 所有批次熟地黃5-HMF峰面積比較

1.梓醇; 2.毛蕊花糖苷.

實驗中發現，當與鐵粉接觸后，竹刀制生地黃藥材顏色加深，干燥后與市售生地黃藥材性狀接近.結合圖2、4和10可看出，生地黃經鐵粉處理后，其梓醇、毛蕊花糖苷及其他共有峰峰面積較之前有所下降，說明鐵會催化生地黃中的某些化學反應，加速某些成分含量改變，并使生地黃顏色變深，與筆者的推測基本一致.因此，在炮制生地黃藥材時應遵循古法炮制原則，避免與鐵等金屬接觸，以防止其藥效成分降低或轉化.

4 結論

利用高效液相色譜指紋圖譜測定，考察了竹刀切制生地黃、古法制熟地黃與市售地黃藥材主要成分的含量差異，并對其原因進行了初步探討.除地黃炮制中未注意避免接觸金屬器具外，現今市售熟地黃炮制亦時間較短且工藝多變，未做到古法中要求的多次蒸曬，使不同方法制得藥材間藥效成分含量差異較大.本文為地黃藥材的炮制規范化和質量標準的完善提供借鑒，保證用藥的安全有效.

[1] 國家藥典委員會.中國藥典，一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：124-126.

[2] 朱少丹，宋緯文.芻議古代中藥加工炮制中的禁忌[J].海峽藥學，1999，11(2)：49-50.

[3] 徐萍.地黃炮制的淵源和存在的問題[J].河南中醫藥學刊，1998，13(1)：24-26.

[4] 蔡瑞利，劉高勝，龔千鋒.地黃炮制的歷史沿革及現代研究[J].江西中醫學院學報，2006，18(3)：40-41.

[5] 曹建軍，梁宗鎖，楊東風，等.應用HPLC指紋圖譜技術確定熟地黃炮制終點[J].中國中藥雜志，2010，35(19)：2556-2560.DOI:10.4268 /cjcmm20101912. CAO J J,LIANG Z S,YANG D F,et al.End point determination by HPLC chromatographic fingerprint in processing prepared Rehmanniae [J].China Journal of Chinese Materia Medica,2010,35(19):2556-2560.DOI:10.4268 /cjcmm20101912.

[6] 楊培民.地黃清蒸不同時間梓醇和5-羥甲基糠醛的含量比較[J].中華中醫藥雜志，2010，25(7)：1096-1098. YANG P M.Companison of catalpol and 5-hydroxymethyl-furfural in Radix Rehmanniae at different processing times [J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2010,25(7):1096-1098.

[7] 曾志，楊東暉，宋力飛，等.高效液相色譜指紋圖譜應用于地黃的研究[J].分析化學，2003，31(12)：1485-1488. ZENG Z,YANG D H,SONG L F,et al.Studies on the application of high performance liquid chromatographic fingerprint to rehmannia glutinosa libosch [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2003,31(12):1485-1488.

[8] 孔珊珊，劉仕偉，李露，等.葡萄糖脫水制備5-羥甲基糠醛的研究[J].化工科技，2013，21(4)：1-3.DOI:10.16664/j.cnki.issn1008-0511.2013.04.011.

[9] 張廣斌，張世曉.葡萄糖注射液不同滅菌條件下5-羥甲基糠醛的含量[J].實用醫藥雜志，2007，24(9)：1076-1076.DOI:10.14172/j.cnki.issn1671-4008.2007.09.086.

[10] 張紅偉，張振凌.炮制對中藥5-羥甲基糠醛成分的影響[J].中國實用醫藥，2009，4(15)：149-151.DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2009.15.024.

[11] 張慧芳.不同炮制方法對地黃中糖類及梓醇含量影響研究概況[J].實用中醫藥雜志，2009，25(7)：501-502.

[12] 朱梅芬，劉向前，吳柱熹，等.地黃的炮制對梓醇和5-羥甲基糠醛含量的影響[J].中國中藥雜志，2007，32(12)：1155-1157. ZHU M F,LIU X Q,WU Z X,et al.Effect of concentration of catalpol and 5-hydroxymethyl 2-furaldehyde from processing ofRehmanniaeRadix[J],Journal Chinese Materia Medica,2007,32(12):1155-1157.

[13] 郭明，何玲，魯小旺.5-羥甲基糠醛與不同血清白蛋白的結合反應機制研究[J].藥學學報，2012，47(3)：385-392.DOI:10.16438/j.0513-4870.2012.03.020. GUO M,HE L,LU X W.Binding mechanism of traditional Chinese medicine active component 5-hydroxymethyl-furfural and HSA or BSA [J].Acta Pharmaceutica Sinica,2012,47(3):385-392.DOI:10.16438/j.0513-4870.2012.03.020.

[14] GUO M,XU X T,WU Z W.Binding mechanism of rhaponticin and human serum albumin [J].Acta Pharmaceutica Sinica,2011,46 (9):1084-1092.DOI:10.16438/j.0513-4870.2011.09.009.

[15] 張欣，廖祥偉，吳松，等.5-羥甲基-2-呋喃甲醛衍生物的合成及降血糖活性評價[J].中國藥物化學雜志，2012，22(5)：349-355.DOI:10.14142/j.cnki.cn21-1313/r.2012.05.005. ZHANG X,LIAO X W,WU S,et al.Synthesis and hypoglycemic activity of 5-hydroxylmethyl- 2-furfural derivatives[J].Chinese Journal of Medicinal Chemistry,2012,22(5):349-355.DOI:10.14142/j.cnki.cn21-1313/r.2012.05.005.

[16] 張麗娜，金國琴.熟地黃有效成分5-HMF對皮質酮損傷型海馬神經元GCR、BDNF、SGK表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2012，27(4)：853-857. ZHANG L N,JIN G Q.Influence of Rehmannia glutinosa’s 5-HMF on protein expression of GCR,BDNF,SGK in hippocampal neurons with corticosterone injury [J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2012,27(4):853-857.

[17] 夏云，李志明，朱丹妮，等.生脈散復方化學動態變化與藥效關系的研究[J].中國中藥雜志，1998，23(4)：230-231. XIA YUN,LI Z M,ZHU D N,et al.A research on chemical dynamic changes and drug efficacy of SMS compound prescription chemical researches on SMS prescription[J].Journal of Chinese Materia Medica，1998,23(4):230-231.

(責任編輯：梁俊紅)

Component comparison of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines

YANG Feifei1,LI Shengnan1,GUO Huaizhong1,YANG Rumin2

( 1.College of Pharmacy,Hebei University,Baoding 071002,China; 2.Yiyuankang Traditional Chinese Medicine Co.Ltd.of Anguo,Anguo 071200,China )

The quality differences of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines were investigated by high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprinting technology,providing reference for the improvement of their quality criterions and the study of their preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata.The samples were extracted with methanol and analyzed by HPLC.The chromatographic conditions were as follows:Welchrom C18 (4.6 mm × 250 mm,5 μm ) column;acetonitrile-0.1% phosphate solution (V/V) was used as mobile phase for gradient elution;multi-wavelength UV detector;the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃;the injection volume was 20 μL.There were significant differences between the ancient preparation and commercial medicines through the comparison of their common peaks.The involved component contents,catalpol and acteoside of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata from ancient preparation were higher than those of commercial medicines;while 5-HMF from ancient preparation were much lower than those of commercial medicines.The preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata are necessary to be further investigated and standardized to ensure their quality and efficacy.

rehmanniae radix;rehmanniae radix praeparata;fingerprints;HPLC;preparation process

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.008

2016-07-06

河北省自然科學基金資助項目(H2016201221)

楊飛飛(1988—)，女，山東濟南人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail：524667972@qq.com

郭懷忠(1968—)，男，內蒙古商都人，河北大學教授，博士，主要從事中藥質量控制及藥效學研究. E-mail：ghuaizh@aliyun.com

O657.8

A

1000-1565(2017)01-0047-09