飼養模式及光周期對中華鱉RNA/DNA比值晝夜節律的影響

冀芳爍，楊振才

(河北師范大學生命科學學院，河北石家莊 050024)

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飼養模式及光周期對中華鱉RNA/DNA比值晝夜節律的影響

冀芳爍，楊振才

(河北師范大學生命科學學院，河北石家莊 050024)

為了探究光周期對中華鱉(Pelodiscussinensis)生長晝夜節律的影響及中華鱉養殖中常用的群體養殖模式(群養)與實驗室研究中常用的單獨養殖模式(單養)對瞬時生長的影響,實驗選用RNA/DNA比值反映中華鱉的瞬時生長情況，以光周期(12 L∶12 D與24 L∶0 D)和飼養模式(單養與群養)為處理因素.實驗進行15 d后，連續24 h內每隔2 h分別從各組隨機取5只鱉，解剖取肌肉組織，測定其RNA/DNA比值.結果表明，中華鱉的RNA/DNA比值存在內源性晝夜節律變化，而群養模式下光周期對該節律的影響更加強烈，完全掩飾了其原本的節律；單養模式下中華鱉的RNA/DNA比值顯著高于群養模式.所以在中華鱉相關研究中，單養模式能更好地反映動物內在的生理過程.

中華鱉；RNA/DNA比值；單/群養；光周期

中華鱉(Pelodiscussinensis)是古老的次生水生爬行動物，隸屬于龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Trionychidae)，在動物界占有獨特的地位，具有重要的研究價值；同時中華鱉也是營養豐富的水生動物，在中國已有很大的養殖規模，已成為中國一種名特優養殖產業.中華鱉養殖模式、養殖管理技術、疾病防治和飼料的研究逐步深入，但相對于養殖產業的蓬勃發展，中華鱉的基礎研究水平還很滯后.

在中華鱉養殖和資源管理的研究中，生長情況是最重要的研究指標之一.動物的生長速度多采用測定一段時間的動物體重的變化來獲得,無法反映動物瞬時生長狀況.近年來，許多學者開始探尋能夠反映生長的瞬時生長指標.RNA/DNA比值能夠反映動物體在幾小時或幾天內生長的變化，該比值已被證實能夠用來指示動物的生長速度、營養狀態以及生長潛能[1-3].RNA/DNA比值作為瞬時生長指標的應用是基于如下假設——細胞中總RNA表達量會隨著蛋白合成需求的增加以及動物體的生長而相應增加，而每個細胞內DNA的含量是相對恒定的[4].大量研究已經證實水生動物的RNA/DNA比值與生長正相關[1-2,5].

晝夜節律是在動物進化過程中形成和發展的一種普遍現象，也是與環境節律變化相適應的一種反應.晝夜節律的研究在魚類中比較多，也比較深入.很多研究已證實，魚類的生長、運動、消化酶活性及內分泌代謝活動等都存在顯著的晝夜節律[6-8].在爬行動物尤其是龜鱉類中關于晝夜節律的研究并不多，主要集中在呼吸和代謝節律的晝夜變化規律上[9].動物的生長在一天內不是勻速的，已有研究顯示，鰣魚(Alosafallaxfallax)、牡蠣(Crassostreaangulata)、蛤仔(Ruditapesdecussatus)的RNA/DNA比值存在晝夜變化[10-11].

光周期是影響動物生長代謝活動重要的環境因子之一.光周期對動物的生長、運動、攝食、個體發育及體內代謝活動均有顯著影響[12-13].在調控動物晝夜節律的環境因子中，光周期是最重要的[14-15]，然而其對動物生長及生理功能的抑制或促進作用存在物種差異[16-17].光周期對中華鱉RNA/DNA比值晝夜節律變化存在怎樣的影響鮮有報道.社群行為(social behaviour)泛指種群中2個或更多個體間的相互作用[18].龜鱉類動物會為了食物、筑巢地、曬背場所而競爭，會產生如撕咬、推拱等攻擊行為，以此在個體間建立獲取資源的等級制度[19-21].在中華鱉養殖中多采用大塘群體養殖模式(群養)，而實驗室研究中則多采用單獨養殖模式(單養)，這種不一致使得實驗室研究結果在實際養殖中的應用受到了一定的限制.目前關于單養和群養研究報道的并不多，大多關注的是其造成傳統生長指標的差異[22-23].

本實驗選擇瞬時生長指標RNA/DNA比值探究中華鱉生長的晝夜節律，同時探究光周期以及2種飼養模式——單養與群養對該節律的影響，有助于完善中華鱉生長機制的理論，為水產精確養殖提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 實驗設計

分別以光周期(12 L與24 L)和飼養模式(單養與群養)為處理因素，實驗共分為4個處理組，IA(單養，24 L)，ID(單養，12 L)，GA(群養，24 L)，GD(群養，12 L).單養處理采用每桶1只實驗動物的飼養模式，群養處理采用每桶5只實驗動物的飼養模式.12 L處理采用12 L∶12 D的光周期，定時開關設定6∶00—18∶00給予光照，24 L處理采用每日24 h連續光照.

1.2 實驗動物和實驗條件

實驗用稚鱉從河北石家莊中華鱉養殖場購得，生長實驗在河北師范大學魚類養殖實驗室進行.養殖桶直徑60 cm，高71 cm，材質為遮光玻璃鋼，桶內總水體積30 L，水深15 cm.水面光強為150 lx.桶內設有恒溫器，水溫保持在(30±0.1)℃；pH保持在7.5～8.0.養殖用水采用自來水，經生石灰(70 mg/L)消毒、曝氣、調溫后使用，每日換水量為桶內總水體積的1/6.實驗所用飼料由河北海泰科技有限公司生產，將其加工為直徑2 mm軟顆粒飼料.

1.3 實驗過程

對實驗動物進行為期7 d的馴化，使其適應實驗室的養殖環境.馴化時光周期統一為12 L∶12 D(6∶00～18∶00給予光照).實驗動物每日飽食投喂2次，投喂時間為8∶30和20∶30，每次投喂30 min后用虹吸管將殘餌及糞便吸出.

馴化結束后，260只中華鱉(平均體重±標準差為(27.73±9.37)g)隨機分入4個處理組，每個處理組65只鱉，進入正式實驗期，除IA和GA 2個處理組的光周期變為24 h全光照外，其余養殖條件與馴化期保持一致，正式實驗首先進行10 d.然后，所有實驗動物開始進行饑餓處理，其余實驗條件均不改變，禁食5 d以消除攝食對RNA/DNA比值的影響.

禁食期結束后，從10點開始，連續24 h內每隔2 h分別從各組隨機取5只鱉，使用MS-222進行麻醉處理.解剖取其前肢肌肉組織(剔除脂肪團)，用7 g/L冰生理鹽水沖洗干凈，并用濾紙吸干后裝入凍存管中，立即液氮冷凍，并轉移到-70 ℃冰箱保存待測.

1.4 RNA/DNA比值的測定

RNA/DNA比值的測定方法參考Xu等[24]的操作步驟略作修改.切取10～15 mg冰凍的組織，使用RNA提取試劑盒(GK3016,上海杰瑞生物工程有限公司)和DNA提取試劑盒(GK0122,上海杰瑞生物工程有限公司)分別將RNA和DNA從每份組織中提取出來，最后通過測定樣品在260 nm處的吸光值換算出核酸含量，以(ng/mg組織濕重)作為單位.每份組織的RNA和DNA分別獨立提取，各做3個重復,最終得到的RNA和DNA樣品在測定其濃度前，先進行純度檢測，即測定其OD260/OD230，該比值的正常范圍是1.8～2.0，不在正常范圍的樣品認為測定過程中核酸受到污染或者降解，測定值不予使用，重新切取組織測定.

1.5 數據分析

所有分析均使用統計軟件STATISTICA(version 10.0)進行.使用3因素方差分析來探究取樣時間、光周期和飼養模式對中華鱉RNA/DNA比值的影響.P< 0.05認為達到統計學顯著差異.

2 結果與分析

3因素方差分析顯示，飼養模式存在顯著差異，單養模式下的RNA/DNA比值顯著高于群養模式(F1,208=155.082,P=0)，進一步分析發現IA處理組的RNA/DNA比值的平均水平比GA處理組高35.84%，ID處理組的RNA/DNA比值的平均水平比GD處理組高61.39%；取樣時間與飼養模式之間交互作用顯著(F12,208=2.347,P=0.008)；光周期與飼養模式之間交互作用顯著(F1,208=7.109,P=0.008).

3 討論

本實驗中4個處理條件下，中華鱉RNA/DNA比值均表現出了顯著的晝夜變化.與本實驗結果類似的鰣魚、牡蠣、蛤仔的RNA/DNA比值同樣存在晝夜變化[10-11].本實驗的單養模式下，全光處理組與12 L∶12 D光周期處理組RNA/DNA比值的晝夜變化模式基本相似，均是在10∶00和22∶00出現峰值.差異僅表現在次日6∶00，全光處理組的RNA/DNA比值處在較高水平的峰值，而12 L∶12 D光周期處理組的RNA/DNA比值卻處于較低的谷值(圖1).Pittendrigh[25]提出，若節律在恒定條件下仍存在，即認為該節律是由內部生物鐘控制的內源性節律.所以本實驗中RNA/DNA比值在光照持續存在的恒定條件下，仍存在與12 L∶12 D光周期下同樣的節律模式，筆者認為中華鱉RNA/DNA比值存在內源性節律變化.紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)的呼吸及代謝活動同樣被證實存在內源性晝夜節律變化[9].此外，猜測中華鱉RNA/DNA比值的內源晝夜節律在6∶00也存在峰值，就如全光處理下所表現的，但是實驗中12 L∶12 D光周期處理組的開燈時間正是早上6∶00，突然給予的光照刺激可能對中華鱉RNA/DNA比值的內源晝夜節律產生了影響，導致2個光周期下中華鱉RNA/DNA比值在6∶00表現出較大的差異.很多文獻已證實光作為一個重要的環境刺激因子，能夠改變生物節律，突然給予的光照同樣會使紅耳龜的呼吸和代謝節律產生明顯的變化[9].而群養模式下，2個光周期RNA/DNA比值的晝夜變化模式卻大不相同(圖2).全光處理條件下中華鱉RNA/DNA比值的內源晝夜節律模式基本仍存在，3個高峰出現在12∶00,次日0∶00及6∶00.而12 L∶12 D光周期處理組的RNA/DNA比值晝夜節律卻完全不同，僅有2個峰值分別出現在20∶00和次日4∶00.筆者認為是群養模式中動物的社群行為與光周期共同作用最終對動物生理過程產生了影響，群養條件下，光周期對節律的影響更加強烈，幾乎完全掩飾了其原本的節律.已有研究證實動物內源性節律的表達是不穩定的，會受到外界刺激因子的修飾而使節律發生比較大的變化[26].然而有研究認為光周期對中華鱉攝食量、生長、能量轉換均無顯著影響，可能是由于該實驗鱉體重范圍較大(12～71.2 g)，體重的影響掩蓋了光周期的影響[27].綜上，筆者認為在中華鱉相關研究中，飼養模式的差別可能會帶來不容忽視的影響，單養模式更能反映動物內在的一些生理過程.

圖1 單養模式中華鱉RNA/DNA比值在不同光 周期下的晝夜變化(n=5)

圖2 群養模式中華鱉RNA/DNA比值在不同光 周期下的晝夜變化(n=5)

本實驗的結果顯示，2個光周期條件下，中華鱉RNA/DNA比值均表現出在單養模式下顯著高于群養模式，這可能是由群體飼養環境下中華鱉之間的社群行為導致的.13周的幼年咸水鱷就已表現出排斥同類的行為，領域性很早就形成了，研究認為攻擊行為可能是造成人工飼養中不同生長速度的主要原因[28].一些使用傳統生長指標的研究結果與本實驗結果相似，群養的中華鱉養殖35 d后特定生長率顯著低于單養的中華鱉[22].0～3周黑羽鵪鶉在生長后期，隨著雛鶉身體發育逐漸完善，體溫調節能力相對穩定，群養個體間開始出現搶食、打斗行為，而單養無爭斗行為，從而導致后期單養組體重顯著大于群養組.同時單養組的產蛋量也高于群養組[23]，說明種內攻擊行為會抑制動物的生長.研究證實群養的中華鱉較單養組的非特異性免疫應答有所加強[22]，說明群養模式下中華鱉可能處于應激狀態.所以，本實驗中群養組的中華鱉可能也是由于存在種內攻擊行為而處于競爭的應激狀態，從而導致了RNA/DNA比值較低，生長受到了抑制.另外，本實驗中2種飼養模式養殖密度的差異同樣可能導致了中華鱉RNA/DNA比值的顯著差異.在水產養殖中，高密度是最常見的壓力因素之一，在擁擠脅迫壓力狀態下，動物的活動加強，用于生長的能量被轉化為運動能，并且導致多種生理性應答，如食欲下降，食物利用率下降，生長下降等[22,29-32].對于養殖密度有2種描述方法，biomass/m2和individual/m2.在短時間內，體重改變微弱，所以對生理特征的影響主要是動物數量[22].研究發現高密度組6只/缸(18.75 只/m2)的中華鱉活動加強，特定生長率下降[22].與此相似，本實驗中群養模式的養殖密度達到了5 只/缸(17.69 只/m2)，說明中華鱉可能存在擁擠壓力脅迫.所以，本實驗中群養組的中華鱉同樣可能由于代謝能較多地轉移為運動能，從而導致了RNA/DNA比值較低，生長受到了抑制.

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(責任編輯：趙藏賞)

Impacts of rearing mode and photoperiod on the daily rhythms of RNA/DNA ratio inPelodiscussinensis

JI Fangshuo,YANG Zhencai

(College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

In this study,the impact of photoperiod on daily growth rhythm and the impact of rearing mode on instantaneous growth ofPelodiscussinensiswere investigated.Turtles are grouply housed in fishery while they are separately housed in laboratory experiments.In this experiment,RNA/DNA ratio was chose to reflect the instantaneous growth inP.sinensis.Two photoperiod regimes—12 h light with 12 h dark (12 L∶12 D) and 24 h light with 0 h dark (24 L∶0 D) accompanied with two rearing modes—individual (I) and group (G) were used as treatment factors.Turtles were housed under specific experimental conditions for 15 days,after then five turtles were randomly sampled from each group every 2 h for 24 h.Muscle tissues were dissected for the measurement of RNA/DNA ratio.The results showed that there exists endogenous circadian rhythm of RNA/DNA ratio inP.sinensis.While the rhythm in turtles grouply housed was strongly influenced by photoperiod,the endogenous rhythm was totally masked.And the ratio in separately housed turtles was significantly higher than that in grouply housed turtles.In conclusion,the individually rearing mode can better reflect the intrinsic physiological process inP.sinensis.

Pelodiscussinensis; RNA/DNA ratio; individually/grouply housed; photoperiod

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.009

2016-04-15

國家自然科學基金資助項目(31172085)；河北省研究生創新項目(sj2015006)

冀芳爍(1988—)，女，河北平山人，河北師范大學在讀博士研究生,主要從事水生動物學方面的研究. E-mail:jifangshuo@163.com

楊振才(1962—)，男，河北行唐人，河北師范大學教授，主要從事水生動物學方面的研究.E-mail:zcyang@hebtu.edu.cn

Q95

A

1000-1565(2017)01-0056-06