氣腫疽梭菌檢測方法概述

張 皓，任春宇，車 達，張永佳，李成輝，金 鑫*

(1.延邊大學農學院，吉林延吉 133000；2.延邊州畜牧總站，吉林延吉 133000；3.延邊州動物疫病預防控制中心，吉林延吉 133000)

氣腫疽梭菌檢測方法概述

張 皓1，任春宇2，車 達3，張永佳1，李成輝1，金 鑫1*

(1.延邊大學農學院，吉林延吉 133000；2.延邊州畜牧總站，吉林延吉 133000；3.延邊州動物疫病預防控制中心，吉林延吉 133000)

氣腫疽(Clostridiumchauvoeiinfection)病原體為氣腫疽梭菌，是一種發生于反芻動物的急性、熱性、敗血性傳染病。常見的典型癥狀為發病動物肌肉豐滿部位發生炎性、氣性腫脹，觸壓有捻發音，該病的流行有一定的地方性、季節性，多發生在潮濕的山谷、牧場，且在天氣炎熱的多雨季節。近幾年常有暴發牛氣腫疽的報道，給養殖業的發展帶來了巨大的沖擊和經濟損失，同時也逐漸地威脅到畜牧生產和人類的安全。國內關于該病的研究多數為病例報道，對于該病的詳細研究和綜述卻是少之又少，論文參考國內外相關文獻，從方法、原理、優缺點等多個方面闡述氣腫疽的檢測方法，以期為該病的診斷提供參考。

氣腫疽梭菌；檢測方法；免疫學；分子生物學

氣腫疽又稱為黑腿病，是由氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)引起的細菌性傳染病[1]。氣腫疽梭菌以芽胞狀態侵入動物機體內后，在腸腺中的無氧條件下出芽繁殖，通過淋巴組織和血液循環到達組織。病原體在肌肉組織受傷時生長繁殖，并產生毒素，組織局部充血、出血和血漿滲出，并產生硫化氫、含鐵血黃素，導致肌肉污黑、發臭，觸壓有捻發音。隨著病情的發展，可引起中樞神經機能障礙病程后期將引發致死性毒血癥或菌血癥[2]。該病多發生于牛羊等反芻動物[3]，近幾年偶爾有人發生感染而死亡的病例，這使得該病迅速成為諸多國家共同關注的焦點和研究熱點。根據其流行特點和病理變化等可做出初步診斷，但該病與炭疽、巴氏桿菌病、惡心水腫有相似之處。筆者通過深入分析，列舉并闡述該病病原體的幾種檢測方法，提出該病快速診斷的有效措施。

1 病原學特點

氣腫疽梭菌又名肖氏梭菌，梭狀芽胞桿菌屬，專性厭氧菌。菌體大小約為0.5 μm～1.7 μm ×1.6 μm～9.7 μm，兩端鈍圓，無莢膜，有周身鞭毛能運動，芽胞位于中央或偏向一端，可在土壤中生存5年之久。氣腫疽梭菌的最佳生長溫度為37 ℃，最適pH為7.2～7.4。在葡萄糖血瓊脂培養基上菌落為圓形、半透明，中心略微隆起的紐扣狀菌落，有微弱的β溶血[4-5]。

2 流行病學特點

氣腫疽的主要傳染源是病牛，病原體來自患病動物的尸體、分泌物或排泄物，在自然界中以芽胞的形式廣泛存在于土壤中，當反芻動物采食被污染的飼草或飲水時感染。通常經過消化道黏膜創傷侵入組織引發感染，也可經創傷或蚊蟲叮咬感染[6]。6月齡～2歲黃牛最易感，牦牛、山羊次之，實驗動物中豚鼠最為敏感[7]。潮濕山谷、沼澤地帶、降水量多的地區易使病原體孳生，該病極易暴發，夏秋兩季氣候溫熱，降水充足，因此成為該病的高發期。在過去幾年的報道中可見該病的流行有一定的地域性、季節性，發病率不高、病死率高，某一地區一旦發病，疫情將會反復發生，并導致牲畜死亡[8]。

3 檢測方法

3.1 常規檢測

主要根據流行病學特點、臨床癥狀及病理特征做出初步判斷。動物感染氣腫疽后表現基本相似，呈現急性發病，體溫達到41℃～42℃，全身癥狀明顯，肌肉豐滿部位發生腫脹，出現跛行，患部皮膚干硬形成壞疽，食欲減退，呼吸困難，常常1 d～3 d內死亡。病畜死后尸體迅速腐敗，四肢僵直，天然孔有泡沫樣血液流出。肌肉橫切面呈黑紅色，肌纖維束有小氣泡脹裂[9]。剖檢可發現口腔黏膜充血，胸腔、腹腔有暗紅色滲出液，腸管空虛，腎盂充血有豆粒大小的壞死灶[10-11]。

鏡檢可見肌肉呈玻璃樣病變，胞核溶解消失，肌纖維間存在病原菌，病變中心區域呈變性壞死。染色后鏡下可見兩端鈍圓的大桿菌，呈革蘭陽性，芽胞位于菌體中央或偏于一端。菌體多為單個存在，也可見兩個相連[12]。

3.2 免疫學檢測

3.2.1 間接ELISA 間接ELISA是在保持抗原免疫活性的條件下，將其結合到某種固相載體表面，使被檢測疑似患病動物血清和酶標記物反應形成抗原抗體復合物，并加入酶作用的底物，最終通過分析反應結束后有色產物的量確定樣品中抗體含量[13]。車達等[14]首次成功構建了氣腫疽間接ELISA檢測方法，以氣腫疽梭菌裂解菌體為抗原，當濃度為50 μg/mL，酶標二抗稀釋度為1∶2 000的條件下，成功建立了病原菌的酶聯免疫吸附試驗。該方法是一種簡便的免疫學檢測方法，有良好的特異性和重復性。

3.2.2 Dot-ELISA Dot-ELISA是將免疫酶固相載體法的反應板用纖維素膜代替，而形成的一種免疫學檢測方法，這種方法彌補了容易包被不牢而造成失敗的缺點，且樣品需求少，節省材料。該原理與ELISA相似，將抗原吸附在纖維素薄膜上，在保持其免疫活性的前提下，與抗原抗體酶標記物產生免疫反應并形成抗原抗體復合物。該復合物可在酶的參與下顯示出色斑，通過色斑的顏色深度即可判定檢測結果。姜詠越[15]應用氣腫疽標準株純化抗原免疫動物制備標準血清作為一抗載體膜，建立了檢測氣腫疽病原體毒素的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測方法。確定了當抗體稀釋度為1∶1 024時，可檢測到最低菌體抗原量為3.15 μg，最低分泌抗原量為1.89 μg，最適酶標二抗濃度為1∶4 000。該方法較ELISA有更高的特異性和敏感性,可以檢測到微量氣腫疽梭菌毒素，且抗體用量少、易于保存、操作方便。

3.2.3 免疫膠體金技術 免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體的一種新型免疫標記技術。任春宇等[16]選用氣腫疽梭菌標準株制備菌體單克隆抗體，并將單克隆抗體與膠體金標記結合，成功研制出了能夠對氣腫疽做出快速診斷的膠體金免疫層析試紙條。該方法與ELISA檢測相比有較高的靈敏度和特異性，可檢測出最低抗原量為1×105CFU/mL，且有較好的穩定性，保存時間長久。

3.3 分子生物學檢測

3.3.1 聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應(PCR)是體外模擬核酸復制的過程，對細菌特異性部分進行檢查。日本研究者Sasaki Y曾以氣腫疽鞭毛基因為目的基因，進行了與其他4種細菌的鑒別檢測。德國幾位科研人員也應用該PCR成功鑒別出氣腫疽梭菌與其他腐敗梭菌。云巾宴等首次以氣腫疽細胞毒素A為基礎，建立了氣腫疽的PCR檢測方法[17-18]，該方法是檢測氣腫疽梭菌相對快速高效的方法，適用于臨床上氣腫疽的診斷。

3.3.2 套式PCR 套式PCR又稱巢式PCR，是一種特殊的聚合酶鏈反應，使用兩對引物擴增完整的片段。這種方法的優點在于第1對引物擴增若發生錯誤，第2對引物將很難配對并擴增，保證了試驗的準確性。姜丹丹等[19]以16 S rRNA為基礎成功建立了氣腫疽梭菌套式PCR檢測方法，該方法與傳統方法相比操作過程簡單，適用于氣腫疽的流行病學調查。

3.3.3 二重PCR 二重PCR是以PCR為基礎，能夠通過一次反應檢測多種病原，適用于病原體的鑒別和分離。彭小兵等[20]綜合了Sasaki Y等的研究方法，以16 S～23 S rDNA間隔區和23 S rDNA的部分序列作為菌株的識別位點，同時添加了腐敗梭菌α毒素基因的特異性引物，最終建立了具有特異、快速且準確的既可以鑒別氣腫疽梭菌，又可以鑒別腐敗梭菌的二重PCR檢測方法。

3.3.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR(real-time PCR)是在PCR反應體系的基礎上加入熒光基團，利用熒光信號的累積同步監測反應進程，再通過標準曲線進行定量分析的方法。Halm A等[21]以16 S rRNA基因序列為模板，建立了氣腫疽梭菌的熒光定量PCR檢測方法，該方法能夠從32個梭菌屬和10個非梭菌屬中準確地鑒定氣腫疽梭菌。Martin L等[22]以spo0A基因為基礎，建立了多重實時定量PCR，快速可靠地鑒定了氣腫疽梭菌與腐敗梭菌等臨床樣本。2011年Garofolo G等[23]建立了多重實時定量PCR檢測方法，以TPI基因序列為模板，設計了特異性引物和探針，也能夠鑒別腐敗梭菌和氣腫疽梭菌。

4 展望

自20世紀以來，氣腫疽在國內20多個地區的暴發為我國畜牧業發展帶來了嚴重的經濟損失。及時鑒別和迅速診斷對于控制該病的流行和暴發極為重要，需要建立針對該病快速有效的診斷方法，采取有效的預防和治療方法控制氣腫疽的流行和蔓延。隨著近年來免疫學和分子生物學等技術的迅速發展，越來越多新型的鑒別診斷方法的出現為該病的防控奠定了基礎。

以上檢測方法各有優勢與局限性，需要針對實際需求、臨床操作條件以及實驗環境，選擇符合條件的病原體檢測方法進行疾病診斷，或同時采用免疫學和分子生物學檢測方法確保診斷的正確性。

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SummaryofMethodsforDetectionofClostridiumchauvoeiInfection

ZHANG Hao1, REN Chun-yu2, CHE Da3, ZHANG Yong-jia1, LI Cheng-hui1, JIN Xin1

(1.DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,Yanji,Jilin,133000,China;2.AnimalHusbandryStationofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China;3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China)

Clostridiumchauvoeiinfection is an acute,febrile,septic infectious disease in ruminants.The typical symptoms of infected animals are inflammation and emphysematous swelling in muscular rich position.When pressing,there is a crepitus.The epidemic ofClostridiumchauvoeiinfection is regional and seasonal, and it usually occurs in the wet valley ranch or the season which is warm and rainy.Recently,the report showedClostridiumchauvoeiinfection erupted in some area,which brought huge economic losses to the development of animal husbandry,at the same time,Clostridiumchauvoeialso affected human security.Majority researches of the infection inland were descriptionS to the cases.The detailed research or summary of it was less.This article summarized the detection ofClostridiumchauvoeiinfection in methods,principles,advantages and disadvantages based on document literatures at home and abroad for providing beneficial reference to diagnose of the infection.

Clostridiumchauvoei;detection method;immunology;molecular biology

2017-02-27

吉林省教育廳“十二五”科學技術重點項目(612014029)

張 皓(1994-)，女，吉林敦化人，碩士研究生，主要從事動物傳染病學研究。*

S852.616

:A

:1007-5038(2017)09-0119-03