兔糞中產纖維素酶菌的分離 篩選與初步鑒定

董小英 ，詹沛運 ，任曉強 ，胡鴻惠 ，唐勝球 *

（1.韶關學院英東農業科學與工程學院，廣東 韶關 512005；2.韶關學院粵北生豬生產及疾病防控協同創新發展中心，廣東韶關 512005；3.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642）

纖維素（cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多 糖，屬于最豐富的綠色可再生資源，且是自然界中含量最多、分布最廣的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。纖維素是植物細胞壁的主要成分，其結構致密、含有大量氫鍵且存在結晶區，不溶于水和一般有機溶劑，只能由纖維素酶水解成單糖才能被人和動物所利用，因此，纖維素的有效利用仍存在不少生物障礙。我國每年有10億t以上的纖維素物質，其中大部分沒有得到充分利用，若該資源有50%被加以利用，就能生產出1.0×107t的酒精[1]?？梢?，纖維素如能充分被人類利用或轉化，將為社會帶來巨大的經濟效益，甚至大大改變當今世界能源需求的結構與格局。

單胃動物體內缺乏β-葡萄糖苷酶，纖維素不能被降解成葡萄糖，難以被機體有效吸收與利用。但纖維素可被大多數草食動物、軟體動物、高等植物、昆蟲、細菌、放線菌和真菌高效降解與吸收，用于自身的營養需求與生長發育，究其原因是以上生物體內能產生降解纖維素的纖維素酶。纖維素酶在自然界分布非常廣泛，除了存在于上述生物體內外，還在反芻動物的瘤胃、草食動物盲腸及豬大腸中有產纖維素酶的細菌存在；而單胃動物因缺乏產生纖維素酶的能力，故對于纖維素的吸收與利用非常有限。

截至目前，關于分解纖維素的微生物資源中，真菌是研究最多的一類[2]，而有關細菌的研究主要是從特殊環境中分離出來的細菌菌株[3～6]。當前，利用微生物產纖維素酶菌將纖維素降解為單糖，并用以解決環境污染、能源短缺及動物消化效率所帶來的世界性難題，已經成為各國專家研究的重點[7]。對國內外現有的研究進行分析后發現，限制纖維素資源應用的主要因素之一是產纖維素酶菌活性普遍不高[8]。因此，對纖維素資源的高效利用，其關鍵是進一步尋找和開發高產纖維素酶能力的菌種，并實現產業化推廣。

家兔為草食動物，消化道內含有自身腸道或外源攝入的產纖維素酶菌，能利用較高纖維素含量的植物作為食物來源，因此，其新鮮糞便中不僅存在大量未被利用的纖維素殘渣，還攜帶著來自腸道或外界的產纖維素酶菌。以普通家兔糞便為樣本，參照孫佑赫等[9]的分離方法稍做改進，以期從兔糞中分離篩選出具有高產纖維素酶能力的菌株，為進一步開發高產纖維素酶菌種服務于現代化畜牧業生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 兔糞 樣品為取自韶關市湞江區某肉兔養殖場健康成年兔的新鮮糞便。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 分離培養基（Luria-Bertani，LB）。分別稱量蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g和瓊脂8 g，放入到500 mL錐形瓶中，加蒸餾水500 mL，調節pH值至中性[10，11]。在瓶口加入1條棉線，用錐形瓶塞塞緊，用報紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌20 min。趁熱倒板，待其冷卻后放入冰箱內備用。

1.1.2.2 純化培養基。與分離培養基相同。

1.1.2.3 產纖維素酶菌篩選培養基。分別稱量羧甲基纖維素鈉 （CMC-Na） 5 g、（NH4）2SO42 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、蛋白胨0.5 g和瓊脂8 g，放入到500 mL錐形瓶中，加蒸餾水至500 mL，pH值自然。在瓶口加入1條棉線，用錐形瓶塞塞緊，用報紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌20 min。趁熱倒板，待其冷卻后放入冰箱內備用。

1.1.3 試劑 試劑有0.1%剛果紅染色液、1 mol/L NaCl溶液、草酸銨結晶紫染色液、150 mg/mL革蘭氏碘溶液、堿性復紅染色液和95%酒精等，均由韶關學院英東農業科學與工程學院動物科學實驗室提供。

1.1.4 儀器與設備 主要儀器設備有LX-01.50L高壓滅菌鍋（購于北京華威興業科技有限公司）、MP1100B電子分析天平（購于上海恒平科學儀器有限公司）、BCD-206ZM2B冰箱（購于合肥美菱股份有限公司）、超凈臺（購于蘇州安泰空氣技術有限公司）、生化培養箱、電熱干燥箱（購于上海申光儀器儀表有限公司）和光學顯微鏡等。所用玻璃器具先用自來水沖洗干凈，晾干后用報紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌15～20 min，然后放在干燥箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化 稱量新鮮兔糞樣品2.41 g，用無菌水溶解成20 mL，取上清液作為原液，待用。分別取原液以及稀釋濃度梯度10-2、10-4和10-6的樣液，在分離培養基（LB）上進行涂布分離，各稀釋濃度均重復3次，置培養箱中37℃倒置黑暗厭氧培養48 h。挑選形態不同的菌落進行劃線純化，同樣條件培養48 h。

1.2.2 產纖維素酶菌的篩選 將純化后的菌株采用點接法接種于產纖維素篩選培養基中，置培養箱中37℃倒置培養72 h。采用剛果紅染色法鑒定產酶能力，并篩選出產酶能力較強的菌株：在平板培養基中倒入0.1%剛果紅染色液5 mL，染色30 min后倒出染液，并用1 mol/L的NaCl溶液5 mL脫色20 min，觀察平板培養基中未染色的透明區域，用卡尺測定透明圈直徑（D） 和菌圈直徑（d），篩選透明圈直徑與菌圈直徑比值（D/d）較大的菌株進行后續研究。

1.2.3 革蘭氏染色（Gram Stain） 和制片 取D/d較大的菌株作為樣本，均勻涂布于玻璃片上，火焰固定，制成抹片。滴加草酸銨結晶紫染色液，處理1～2 min，水洗；加革蘭氏碘溶液于抹片上，作用3min，水洗；隨后用95%酒精進行脫色，作用1 min，水洗；加堿性復紅液復染30 s，水洗，烘干制成標本[12]。

1.2.4 產纖維素酶菌株的鑒定 將標本在油鏡下進行革蘭氏染色鑒定和形態學鑒定，記錄并拍照。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

培養48 h后，從兔糞樣品中分離出乳白和金黃2種顏色的菌落（圖1）。其中，乳白色菌落占優勢，菌落形態呈圓形凸起，表面有光澤，邊緣圓滑整齊、無滲出液；金黃色菌落在培養基上呈零星分布，菌落形態呈圓形凸起，表面有光澤，邊緣呈鋸齒狀、無滲出液。從中挑選出形態各異的菌株48株，于37℃純化培養48 h，均能正常生長。

圖1 分離培養的菌落Fig.1 Isolated and cultured colonies

2.2 產纖維素酶菌的篩選

經剛果紅染色并脫色后發現，CMC-Na培養基均呈紅色（圖2），其中，5個培養基中出現了水解的透明圈共8個，即具有產纖維素酶能力的細菌只有8株。

圖2 剛果紅染色后的產纖維素酶菌Fig.2 Cellulose producing bacteria by Congo red stain

對這8株細菌的透明圈和菌圈直徑進行測量，結果（表1）顯示，各菌株的透明圈和菌圈直徑及其比值差別較大，其中，SK1和SK6菌株的D/d＞4，明顯＞其他菌株。表明SK1和SK6菌株的纖維素酶活性顯著高于其他菌株。因此，挑選出SK1和SK6作為最終目標產纖維素酶菌株進行后續研究。

表1 菌株的透明圈和菌圈直徑及其比值Table 1 Ratios of transparent circle diameter to colony diameter

2.3 產纖維素酶菌的形態學鑒定

革蘭氏染色后進行鏡檢，結果（圖3和4） 顯示，SK1和SK6兩目標產纖維素酶菌菌株均呈藍紫色，桿狀。表明二者革蘭氏染色均為陽性。故初步得出目標菌株均為革蘭氏陽性菌（G+菌），且為桿菌[13～15]。

圖3 革蘭氏染色后的SK1菌株Fig.3 SK1 strain after Gram’s stain

圖4 革蘭氏染色后的SK6菌株Fig.4 SK6 strain after Gram’s stain

3 結論與討論

3.1 討論

3.1.1 水解圈與酶活性 產纖維素酶菌可以通過剛果紅染色法來進行快速鑒定與簡便篩選，該菌的產纖維素酶能力可根據透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）直接反映，原理是剛果紅是一種能夠與大分子多糖相結合的染色劑，使用后與大分子多糖的纖維素結合形成紅色。CMC平板內的纖維素被產纖維素酶菌產生的產纖維素酶水解，形成了小分子還原糖，所以經剛果紅染色后，沒有被水解的纖維素與剛果紅結合呈現紅色，而水解部分由于缺少大分子多糖，不能與剛果紅作用染成紅色，而是呈現出未染色的透明圈。因此，透明圈直徑與菌圈直徑的比值反映了纖維素酶的活性和菌落的產酶能力，比值越大表示酶活越強，反之越弱。本研究中，經過剛果紅染色并脫色后發現，5個培養基中共出現了8個水解透明圈，即篩選出8株具有產纖維素酶能力的細菌。

3.1.2 革蘭氏染色鑒定 從化學組成和生理性質上來說，革蘭氏陽性菌（G+菌） 和革蘭氏陰性菌（G-菌）存在明顯差別，其染色結果也不一樣。G+菌體內含有獨特的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，能與碘和結晶紫的復合物牢牢地結合，不易脫色；而G-菌與該復合物結合程度較低，吸附染料的效果很差，極易被酒精脫色。因此，G+菌染色反應呈藍紫色，G-菌染色反應呈紅色。

家兔屬草食性動物，其飼料大部分是植物成分，所以，兔糞中存在大量的來自外界和腸道中的產纖維素酶菌。本研究以普通家兔新鮮糞便為樣本，從中分離出2種菌落形態不同的細菌。新鮮兔糞中存在一些腸道內的細菌，而在腸道微生態環境中生存的細菌大多是不可培養的，因此，分離出的細菌僅僅是其中的一部分[16]。從分離出來的細菌中按照比例挑選48株，并接種到產纖維素酶菌篩選培養基中進行進一步的篩選，72 h后通過剛果紅染色法對CMC培養基進行染色，脫色后各平板上共出現8個大小不一的透明水解圈，即有8株菌株具有產纖維素酶菌的能力，挑選率為16.67%。本研究條件下挑選率較低，分析原因是進行篩選培養時沒有采取黑暗培養，部分細菌由于離開了腸道的黑暗厭氧環境，在有氧的情況下影響了其正常的生命活動，導致其死亡或產酶能力下降等。對篩選出的菌株進行D/d分析，結果顯示，有2株菌株D/d＞4.00，產纖維素酶活性較高。選擇這2株細菌作為目標菌株進行革蘭氏染色鑒定，二者均為革蘭氏陽性菌（G+菌），形態為短棒狀，屬于桿菌。

產纖維素酶菌在世界上分布十分廣泛，發掘與研究不同的產纖維素酶菌對人類更好地利用纖維素資源具有重要意義。對兔糞中存在的產纖維素酶菌進行初步研究，目的是為今后研究與利用兔糞中的產纖維素酶菌提供科學理論和奠定基礎。

3.2 結論

從普通家兔新鮮糞便中分離并篩選出了具有較高酶活性的產纖維素酶菌菌株SK1和SK6，采用革蘭氏染色初步鑒定為革蘭氏陽性菌（G+菌），屬于桿菌。從本研究中得到提示，利用兔糞可分離篩選出具有較高酶活的產纖維素酶菌，若能加以開發利用將具有較高的市場價值與應用前景。

［1］劉海波，王義強，陳介南，張偉濤，韓 笑.一株高產纖維素酶菌的篩選與鑒定［J］.生物學雜志，2008，25（3）：16-20.

［2］胡艷平，王 磊，曹平華，胡雄兵，方明建，陳玉林.纖維素酶產生菌的篩選、其酶學性質及對飼料粗纖維降解效果的研究［J］.飼料工業，2013，34（8）：21-27.

［3］邱成書，榮 華，劉會明，鄧 宇，胡國全，徐 恒.極端嗜熱纖維素分解菌分子特征［J］.四川大學學報：自然科學版，2005，42（1）：185-189.

［4］ Rastogi G，Muppidi GI，Gurram RN.Isolation and characterization of cellulose-degrading bacteria from the deep subsurfaceoftheHomestakegold mine， Lead， South Dakota，USA ［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36（4）：585-598.

［5］曲小爽，頓寶慶，郭明鳴，宋立立，許修宏，張保明，路明，李桂英.一株嗜纖維素分解菌的分離及其酶學性質的初探［J］.中國農業科技導報，2009，11（1）：124-128.

［6］ Ogura J，Toyoda A，Kurosawa T.Purifiction，characterization and gene analysis ofcellulase（Cel8 A） form Lysobactersp.IB-9374 ［J］.BiosciBiotechnolBiochern，2006，70 （10）：2420-2428.

［7］于 婷，傅永福.纖維素乙醇發展的現狀與對策［J］.中國農業科技導報，2008，10（S1）：35-40.

［8］高培基，曲音波.微生物降解纖維素機制的分子生物學研究進展［J］.纖維素科學與技術，1995，3（2）：1-19.

［9］孫佑赫，周開艷，熊 智.云南松毛蟲腸道產纖維素酶菌株的篩選鑒定及酶學性質［J］.華北農學報，2012，27（S1）：254-258.

［10］奧斯伯F，布倫特R，金斯頓RE.精編分子生物學實驗指南［M］.北京：科學出版社，2001：388-389.

［11］祖若夫，胡寶龍，周德慶.微生物學實驗教程［M］.上海：復旦大學出版，1993：108-111.

［12］黃青云.畜牧微生物學［M］.北京：中國農業出版社，2009.

［13］周德慶.微生物實驗手冊［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1986：65-70.

［14］布坎南RE，吉本斯NE.伯杰細菌鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，1984.

［15］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［16］ Dillon RJ，Dillon VW.The gut bacteria of insects：nonpathogenic interactions［J］.Annual Review of Entomology，2004，49：71-92.

［17］何 特，李 妮，黃小菲，楊志榮，張 杰.青藏高原高寒濕地產纖維素酶菌株的分離、鑒定和產酶的初步研究［J］.中國農業科技導報，2009，11（4）：112-117.

［18］葉姜瑜.快速識別纖維素分解菌的新方法［J］.生物學通報，1997，32（12）：34.