補中益氣湯對A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF—κB，caspase—9，Survivin，mTOR表達的影響

劉亞莉+易佳麗+劉春英

[摘要] 探討補中益氣湯對A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR表達的影響。BALB/C裸鼠60只隨機分為空白對照組、荷瘤對照組、順鉑組和補中益氣湯高劑量+順鉑組（高聯組）、補中益氣湯中劑量+順鉑組（中聯組）、補中益氣湯低劑量+順鉑組（低聯組），培養A549/DDP細胞（濃度為5×106個/mL），接種于各組，觀察各組成瘤情況。給予相應治療，14 d后取瘤組織固定、切片，免疫組織化學方法、Real-time PCR方法檢測各組裸鼠移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR 蛋白和mRNA的表達水平。結果顯示補中益氣湯聯合順鉑可降低移植瘤體積，中聯組和高聯組的抑瘤率與順鉑組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；與荷瘤對照組比較，中聯組和高聯組Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的蛋白和mRNA的表達明顯減少（P<0.05），caspase-9的蛋白和mRNA在中聯組和高聯組的表達逐漸增多，與荷瘤對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；Bad，NF-κB，caspase-9的mRNA，中聯組和高聯組與順鉑組、低聯組、荷瘤對照組比較有統計學意義（P<0.05），低聯組、順鉑組、荷瘤對照組兩兩比較，無統計學差異，各因子蛋白和mRNA的表達中聯組和高聯組比較，無統計學意義。結果表明補中益氣湯與順鉑聯合作用可抑制A549/DDP移植瘤的生長，補中益氣湯抑制A549/DDP移植瘤的作用可能是通過調節Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR，促進細胞凋亡實現的。

[關鍵詞] 補中益氣湯； A549/DDP； 裸鼠； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

[Abstract] This study was aimed to explore the effects of Buzhong Yiqi decoction on the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR in nude mice with A549/DDP transplantation tumors.Sixty BALB/C mice were randomly divided into blank control group， tumor-bearing control group， cisplatin group and Buzhong Yiqi decoction of high， medium and low doses+cisplatin groups （hereinafter referred to as the high，medium and low combined groups）. A549/DDP cells （concentration of 5×106 cells/mL）were cultured and inoculated in various groups， then the tumor-forming situations were observed. Corresponding treatment was given in all groups. Fourteen days later， immunohistochemistry and Real-time PCR methods were used to detect the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， mTOR protein and mRNA in tumors.Results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin could reduce the volume of transplanted tumors， and there was significant difference between medium combined group and high combined group（P<0.05）. As compared with the tumor-bearing control group， the expression levels of Bad， NF-κB， Survivin and mTOR were significantly reduced in medium and high combined groups（P<0.05）； the protein and mRNA expression levels of caspase-9 were gradually increased in medium combined and high combined groups（P<0.05）， with statistical difference with tumor-bearing control group（P<0.05）. There were statistical difference in mRNA expression of Bad， NF-κB and caspase-9 between medium combined group， high combined group and cisplatin group， low-combined group， tumor-bearing control group（P<0.05）， but there was no statistical difference between cisplatin group， low-combined group， and tumor-bearing control group. In addition， there was no statistical difference between medium combined group and high combined group in protein and mRNA expression levels of various factors. Experimental results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin can inhibit the growth of A549/DDP transplanted tumors， and the mechanism may be associated with regulating Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR levels as well as promoting apoptosis.

[Key words] Buzhong Yiqi decoction； A549/DDP； nude mice； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

肺癌已成為威脅居民健康的主要疾病之一，其發病率的上升趨勢與吸煙等不良生活方式的增多、空氣質量下降等因素有關[1]。肺癌作為腫瘤死亡的首要原因，受到全世界的廣泛研究。肺癌由于不易及早發現，在失去手術治療機會時就只能以放、化療為主?；煹目陀^有效率約30%，中位生存期8～10個月，1年生存率30%～40%，且不良反應較嚴重，多數患者難以完成有效的治療周期[2]。袁惠芳等[3]發現采用培美曲塞聯合鉑類方案治療晚期肺癌時加以補中益氣湯輔助，可在一定程度上提高聯合用藥療效，并明顯減輕化療所致胃腸反應，降低不良反應發生風險，提高患者治療期間生活質量。劉明等[4]研究發現化療聯合補中益氣湯加減在治療中晚期非小細胞肺癌時臨床療效有所提高，而且在明顯改善患者生活質量的基礎上有效降低骨髓抑制的發生率。

本研究將人肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP細胞接種裸鼠，制備成荷瘤模型，用不同濃度的補中益氣湯和順鉑進行干預，將順鉑作為陽性對照，采用一般性觀察、免疫組織化學、Real-time PCR等方法，評價補中益氣湯對移植瘤生長的影響，并探討其作用機制，為應用補中益氣湯干預肺癌順鉑耐藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物及細胞 BALB/C裸鼠，SPF級，5周齡，雌雄各半，體重（20±2） g，購自北京維通利華動物實驗技術中心，動物許可證號SCXK（京）2012-0001，A549和A549/DDP細胞株購自中國醫學科學院腫瘤研究中心細胞庫。

1.2 藥物制備 補中益氣湯生藥購于遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房，組成參照《方劑學》新世紀版規定，按“動物與人體的每千克體重劑量折算系數表”[5]，計算裸鼠的等效劑量，按成人日推薦量的2，1，1/2倍設置高、中、低劑量組。常規煎制成每毫升含生藥3.939，1.970，0.985 g。

1.3 儀器及試劑 formaUL-1168751H CO2孵育箱（Thermo Fisher Scientific美國）；PE 9700PCR擴增儀（美國）；KOHTRON高速低溫離心機（瑞典）；BT-31恒溫水浴振蕩儀（日本，KAMAMOTO）；紫外分光光度計（英國UV-visible Spectrometer，UV300）。Survivin抗體、mTOR抗體（南京凱基生物技術有限公司），鼠抗人Bad，NF-κB，caspase-9單克隆抗體（PTGLAB公司），Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，引物合成由北京華大基因公司提供。注射用順鉑（齊魯制藥廠生產，生產批號2030132DB）。

2 方法

2.1 細胞懸液配制人肺腺癌耐藥細胞株 A549/DDP按常規5%CO2，37 ℃孵育箱中培養，每2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化，3～4 d傳代1次。傳代擴增細胞數量至足夠時，收集對數生長期A549/DDP細胞，0.25%胰蛋白酶消化制成細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液，以PBS洗滌，調整細胞濃度為5×106個/mL，制備成A549/DDP細胞懸液。

2.2 移植瘤制備及標本收集 60只裸鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為6組：①空白對照組，②荷瘤對照組，③順鉑組，④補中益氣湯高劑量+順鉑組（高聯組），⑤補中益氣湯中劑量+順鉑組（中聯組），⑥補中益氣湯低劑量+順鉑組（低聯組），每組10只。①組裸鼠給予腹股溝皮下接種0.2 mL/只生理鹽水；②～⑥組裸鼠給予腹股溝皮下接種A549/DDP細胞懸液0.2 mL/只。觀察各組成瘤情況，待肉眼觀察到移植瘤出現時，空白對照組、荷瘤對照組給予生理鹽水0.5 mL灌胃；順鉑組給予等量生理鹽水灌胃的同時，腹腔注射順鉑2 mg·kg-1；高聯組、中聯組、低聯組分別給予高、中、低濃度的補中益氣湯0.5 mL灌胃，同時腹腔注射順鉑2 mg·kg-1，每日1次，14 d后，無菌剝離瘤體，稱瘤重，游標卡尺測量腫瘤最大長徑（a）和橫徑（b），瘤體標本部分用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，免疫組化檢測；部分迅速置于-80 ℃冰箱保存，做Real-time PCR。

2.3 免疫組化方法檢測移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR的表達 取出固定樣本，經常規脫水，透明、浸蠟，包埋后，將每個樣本蠟塊連續切片3張，每張厚約4～5 μm。切片常規脫蠟至水，PBS清洗5 min，2次，高壓熱修復，內源性過氧化物酶阻斷，PBS清洗5 min，2次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗5 min，2次，加二抗37 ℃孵育45 min，PBS清洗5 min，2次，DAB顯色，透明后封片。以PBS代替一抗作為陰性對照組。免疫組化結果采用Image Pro Plus醫學圖像分析系統進行圖像分析，在400倍高倍鏡下，分別測出陽性反應細胞的總面積（Area） 和積分光密度（IOD），求出平均光密度（AOD）。

2.4 Real-time PCR技術檢測各組移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR mRNA的表達 利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，PCR 引物見表1。取各組樣品，分別進行總RNA的提取，待樣本純度檢測計算合格后，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA，反應條件37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，1個循環。進行PCR擴增，反應條件為95 ℃ 0.5 min，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，1個循環；PCR擴增的反應體系為20 μL。各基因完成PCR擴增循環后，進行產品熔解曲線分析，以確定產品純度。根據PCR產物熔解曲線的平均熔解溫度確定產物的純度。根據系統給出數值，計算各組mRNA的表達比率，進行分析。

2.5 統計學分析 運用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用±s表示。各組數據符合正態分布，方差齊時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；不符合參數檢驗者，采用多組計量資料秩和檢驗。P<0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 補中益氣湯對荷瘤裸鼠一般狀況的影響 各組實驗動物活動良好，未見明顯的拒食、不安、便溏現象。高聯組裸鼠體重與空白對照組比較，無明顯變化，各組間無統計學差異。致瘤率以實驗結束時，解剖出瘤組織并經HE染色證明為標準，高聯組有2只，中聯組有1只，未出現瘤組織，從樣本含量上給予剔除。隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積減小，高聯組、中聯組抑瘤率與順鉑組比較差異有統計學意義（P<0.05），低聯組與順鉑組比較則無顯著差異，見表2。

3.2 免疫組織化學方法檢測各組移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR蛋白表達 各組Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的表達顯示，各組中均有棕黃色顆粒表達，荷瘤對照組最多，順鉑組和低聯組表達量有所減少，而中聯組和高聯組表達最少。統計學分析顯示，中聯組和高聯組與荷瘤對照組、順鉑組、低聯組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；低聯組、荷瘤對照組、順鉑組兩兩比較無統計學差異；中聯組和高聯組比較則無統計學意義，見圖1～5。

caspase-9蛋白在各組中的表達情況為：荷瘤對照組中棕黃色顆粒最少，中聯組和高聯組棕黃色顆粒最多，順鉑組和低聯組居中。經統計學分析：中聯組和高聯組與荷瘤對照組、低聯組和順鉑組比較有統計學差異（P<0.05），低聯組、順鉑組和荷瘤對照組兩兩比較則無統計學意義。見圖3，6。

4 討論

在肺癌的化療過程中，耐藥和毒副反應是多種多樣的。如食欲減退、嘔吐、骨髓抑制等。對補中益氣湯的研究很多，沈富林等[7]研究證明，在多種腫瘤的聯合化療方案中采用補中益氣方，均可有效減輕化療的毒副反應。除此之外，將單純化療法和化療聯合補中益氣湯法進行對比研究，可以發現，與單純化療組相比，聯合組患者毒副反應的發生率顯著降低，李雁等[8]進行的相關研究證實了此結果。同時，還有大量的研究表明，在腫瘤尤其是肺癌的化療方案中，應用補中益氣湯藥不但緩解患者在化療期間的不適反應，還可提高放療耐受性，特別是能夠減少放射治療所致炎癥反應[9]。本研究以先天性缺乏胸腺的裸鼠為研究對象，采用典型的肺腺癌細胞系A549/DDP細胞，以皮下移植的方式造模，呈瘤率都在90%以上。在增加了補中益氣湯的干預后，與順鉑組比較，抑瘤率明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），提示補中益氣湯與順鉑的抑瘤作用有協同效應。免疫組化的結果表明，順鉑聯合補中益氣湯干預后Bad，NF-κB，Survivin，mTOR蛋白的表達明顯減少，caspase-9蛋白的表達增多，與順鉑組比較有統計學差異（P<0.05），提示聯合應用順鉑和中、高劑量的補中益氣湯后，下調了腫瘤組織中抗凋亡因子Bad，NF-κB，Survivin，mTOR等因子的表達，并且上調促凋亡因子caspase-9的表達，而在基因檢測方面，Real-time PCR的結果顯示以上各因子mRNA的表達與蛋白表達的變化是一致的，提示補中益氣湯對肺癌順鉑耐藥相關因子的干預是在基因水平上發生的，增加腫瘤細胞的凋亡，從而使瘤組織體積縮小。

順鉑在進入腫瘤細胞之后，與細胞的DNA形成加合物并激發細胞周期的停止和凋亡過程的啟動，所以在此過程中，阻礙順鉑與DNA的加合物形成，或其調節腫瘤細胞周期引發腫瘤細胞凋亡的因素都有可能引起順鉑耐藥[10]。核因子-κB（NF-κB）是廣泛存在于真核生物中的一種多功能的核轉錄因子，在惡性腫瘤的發生、發展和轉移中有重要的促進作用，這是因為NF-κB能夠控制多種細胞因子和生存基因表達[11]。Survivin是一種在腫瘤內皮細胞中持續表達的特異性凋亡抑制因子，抑制Survivin的表達可有效減少腫瘤血管的生成，有研究證明，腫瘤細胞中大多數血管生成或抑制因子都是通過調節Survivin的表達來發揮作用的[12]。王淳等[13]研究發現補中益氣湯含藥血清可激活A549 細胞內caspase-3依賴的細胞凋亡發生，其作用是通過提高A549細胞ROS水平，并激活其下游各級激酶產生的。王雨等[14-15]研究發現補中益氣湯不但可上調caspase-9 mRNA和蛋白表達水平，也可增加caspase-3 蛋白的表達，從而使二者共同作用，增強誘導腫瘤細胞凋亡的作用。促凋亡蛋白Bad通過結合并滅活抗凋亡的Bcl-2家族蛋白發揮促進凋亡的作用。在之前的研究中，本課題組已經闡述補中益氣湯可能通過調控PI3K，AKT基因和蛋白的表達而干預順鉑的耐藥機制，并且這種干預作用具有一定的量效關系[16]。PI3K/AKT通路可導致細胞凋亡的抑制，順鉑與腫瘤細胞的DNA結合后，即DNA收到了損傷，這種損傷信息可激活PI3K/AKT通路，從而引起細胞凋亡閾值增高，產生了對順鉑的耐受。本研究為了解補中益氣湯在PI3K/AKT信號轉導通路中的作用，檢測了此通路下游促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR在補中益氣湯干預時表達的變化，為解釋臨床應用補中益氣湯改善肺癌順鉑耐藥提供實驗依據。

綜上，補中益氣湯抑制肺癌腫瘤生長的作用，可能是通過調節A549/DDP細胞中的促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR，促進腫瘤細胞凋亡而實現的，補中益氣湯是培土生金法的代表方藥，對肺癌患者補虛扶正、培本固元、改善患者生活質量、逆轉肺癌順鉑耐藥的作用，值得進一步研究。

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