基于液質聯用技術的金鈴子散亞急性毒性代謝組學

沈淑潔+水素芳+肖炳坤+楊建云+黃榮清

[摘要] 為進一步了解金鈴子散毒性影響的代謝特征，探索金鈴子散在治療過程中對未知生物通路的作用。該實驗通過以金鈴子散3組劑量的水煎劑對大鼠肝腎的影響，來研究金鈴子散對大鼠體內代謝組改變的特點和規律。首先對給藥2周和給藥后1周大鼠尿液和血清樣本采用質譜分析方法，通過XCMS在線分析大鼠正負模式離子檢測譜，對代謝譜分析的代謝物進行鑒定，結果得到44個差異性物質。最后以MetPA對液質實驗中篩選出的代謝物組進行代謝通路富集和分析，結果得到：類固醇激素合成代謝途徑，戊糖和葡萄糖醛酸轉換，賴氨酸代謝，谷胱甘肽代謝和抗壞血酸代謝5條相關的代謝通路。 由代謝網絡圖可以看出，與毒性相關的通路主要和生物體賴氨酸代謝、葡萄糖醛酸轉化及激素代謝有關，尤其是賴氨酸和谷胱甘肽的代謝失衡，造成機體能量代謝或氧化應激調節的紊亂，產生大鼠體內的損傷。從金鈴子散低、中、高3組劑量的亞急性毒性實驗結果觀察發現，金鈴子散19.7 g·kg-1和 39.4 g·kg-1劑量組造成了明顯的毒性作用，說明金鈴子散在生物體內可產生毒性作用，且毒性隨著給藥劑量的增加而增加，造成不可逆的機體損傷。

[關鍵詞] 金鈴子散； 毒性； 代謝組學； 液質聯用

[Abstract] To further understand the metabolic characteristics of Jinlingzi powder toxicity effect in rats and explore the effect of Jinlingzi powder on unknown biological pathways in the treatment process. In this experiment， the effect of three doses of Jinlingzi powder decoction on rat liver and kidney was investigated to explore the characteristics and rules of Jinlingzi powder on in vivo metabonomic changes in rats. First， urine and serum samples of the rats were used for LC-MS analysis. Under the XCMS online analysis， 44 differential substances were found in the identification of metabolites. Finally， Metpa was used for metabolic pathways enrichment and analysis， and five related metabolic pathways were obtained： steroid hormone biosynthesis， tryptophan metabolism， pentose and glucuronate interconversions， ascorbate and aldarate metabolism， as well as glutathione metabolism. Metabolic network diagram showed that the toxicity-related pathways were mainly associated with lysine metabolism in living organisms， glucuronic acid conversion， and hormone metabolism， especially the metabolism imbalance of lysine and glutathione would result in the disorder of energy metabolism or oxidative stress regulation， and thus inducing the damage in rats. Subacute toxicity test results for three doses groups （low， middle and high doses） showed that， Jinlingzi powder with doses of 19.7 g·kg-1 and 39.4 g·kg-1 caused obvious toxic effect， indicating Jinlingzi powder could produce toxic effect in vivo in a dose-dependent manner， and cause irreversible damage to the body.

[Key words] Jinlingzi powder； toxicity； metabonomics； LC-MS

代謝組學主要研究機體小分子代謝物與疾病的關系以及揭示機體內生物化學變化的規律。將這樣的方法應用在中藥毒性的研究中可以較容易的發現毒性作用的物質基礎和作用機制，對追蹤毒性作用的相關代謝途徑，尋找代表性的生物標志物有重要作用[1-2]。

疏肝泄熱名方金鈴子散由川楝子和延胡索組成，而兩藥均有一定的肝腎毒性，尤其是川楝子早在《名醫別錄》就有記載“楝實有小毒。根微寒。治蛔蟲， 利大腸。生荊山” [3]。 但作為中藥復方金鈴子散毒性的探索并沒有報道，為進一步明確金鈴子散對機體肝腎代謝機制的影響和產生的毒性作用，本實驗從代謝組學的視角對金鈴子散作用于肝腎毒性的影響以及毒性標志物的確定進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200/6410三重四級桿液質聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）；HP ODS C18色譜柱（4.6 mm×100 mm， 5 μm）；大鼠不銹鋼代謝籠（北京龍東?？蒲性O備制造有限公司）；TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；LGJ-25C冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠）。

0.9%生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；甲酸（50%水溶液，色譜純，美國 Sigma-Aldrich 化工有限公司）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司）；疊氮化鈉（NaN3，英國Alfa Aesar化工有限公司）；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；純化水（屈臣氏集團有限公司）；延胡索（北京同仁堂有限責任公司，批號404002248P）；川楝子（北京同仁堂有限責任公司，批號101152286W）。

1.2 金鈴子散水煎液的提取 川楝子和延胡索各1 000 g，加10倍量水浸泡6 h，煎煮1 h，用醫用紗布過濾，混合第2次和第3次煎煮液，回流1 h，合并3次濾液，減壓濃縮至浸膏狀，濃縮至750 mL，然后在冷凍干燥機上進行干燥處理，濃縮液和藥材之比為1∶2.67（相當于1 mL濃縮液含生藥材2.67 g）， 提取的生藥量為37.5%，4 ℃冷藏備用。

1.3 動物分組及給藥 SD大鼠雄性48只，體重 180～220 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK-（軍）2012-0004，所有大鼠均單代謝籠飼養，溫度 23～25 ℃， 相對濕度保持在55%～65%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。

適應環境1周后，隨機分為金鈴子散9.85，19.7，39.4 g·kg-1組（分別相當于成人臨床給藥劑量的 5，10，20倍）和空白對照組，每組12只?？瞻讓φ战M給予相應體積的生理鹽水，浸膏用生理鹽水稀釋后灌胃給藥，給藥量分別為9.85，19.7，39.4 g·kg-1，每天1次，連續給藥2周。

1.4 樣品采集及處理 給藥2周后，每組取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1，ip）深度麻醉，下腔靜脈采集血液，于室溫下靜置 10 min，析出血清，251.5×g 離心10 min，取血清于 EP管中， 置于-80 ℃冰箱保存。各實驗組中剩下的6只進行恢復期間實驗（不予灌藥，自由飲食飲水，觀察其體內受金鈴子散毒性影響的恢復情況），期間不進行給藥操作，自由飲食飲水，觀察大鼠對金鈴子散毒性的恢復情況，7 d后剖殺，收集血液，臟器（肝、腎）。大鼠尿液分別于第3天，第7天，第10天，第14天，第17天，第21天收集。收集的尿液于-80 ℃條件下低溫保存。取200 μL解凍后血清加入800 μL乙腈溶液沉淀蛋白，4 ℃ 251.5×g離心15 min，移取上清液供 LC-MS分析。

1.5 色譜質譜條件 HP ODS C18 Hypersil色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm）；流動相A為H2O（含0.1%甲酸），流動相B為乙腈，梯度洗脫，0～3 min，5%～10% B，3～8 min，10%～55% B，8～12 min，55%～65% B，12～15 min，65%～90% B，15～22 min，90%～10% B，22～28 min，10%～5% B，流速0.3 mL·min-1；進樣量2.0 μL；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm。質譜條件：采用正負離子MS2 Scan 模式進行數據采集，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L·min-1，霧化器壓力50 psi（1 psi=6.895 kPa），毛細管電壓（+）4 000 V，（-）3 500 V，掃描范圍m/z 50～1 000，掃描時間200 s，Fragmentor 135 V，采集速度2 Hz，Delta EMV （+） 200 V，（-） 250 V。

1.6 數據處理 將液質聯用采集到的數據上傳至 XCMS 數據處理平臺進行質譜特征離子評估。通過 XCMS分析結果對峰值保留時間偏差進行質控評價，手動提取組間差別較大的化合物信息（P<0.05），并根據平臺生成的 PCA 結果，篩選多元統計分析中變異最大的化合物，通過匹配在線質譜數據庫，鑒定并驗證所得結果的正確性。將分析的數據上傳到 MetPA 數據處理中心，通過與 KEGG 數據匹配ID 后，尋找相關的代謝通路和相關的網絡構建。以 Fishers 正確性檢驗和超幾何分布檢驗對數據在特定生物途徑中的隨機性進行測試。另外部分差異性代謝物通過在相同液相條件下，比對三重四極桿串聯質譜儀上的保留時間和相對分子質量來確認。最后根據得到的 MetPA 預測數據，進行代謝機制推斷和解釋。

1.7 統計學分析 所得實驗數據利用SPSS 19.0 軟件進行組間樣本方差分析（ANOVA），并結合方差分析中的 LSD 和 SNK 法對樣本組間差異情況進行分析。

2 結果

2.1 大鼠尿液隨時間變化的統計分析結果 取不同時間段金鈴子散39.4 g·kg-1劑量組大鼠尿液進行液質數據采集，將LC-MS分析的結果進行統計分析。

差異代謝物組篩選與鑒定提取中，將液質聯用分析的正負離子數據，經標度化預處理數據后，以XCMS 建立2種離子模式數據的 PCA 模型，見圖1。正負離子模式下，主成分分析所得的前3個主成分方差貢獻率（R2）及累計貢獻率（Q2）分別為 0.610（0.871）， 0.720（0.952）。說明2種模式下的 PCA 模型有60%以上的變量可用于預測金鈴子散高劑量組毒性對不同劑量大鼠之間 87%以上的差異，模型預測能力良好。由圖可以看出隨著給藥次數的累積，大鼠尿液里的代謝物變化逐漸偏離0 d時的代謝物組群，且呈現明顯的規律性變化。

2.2 液質數據分析結果 為了減少組間差異，以隨機進樣的方式，交替進樣。將LC-MS采集到的數據，通過 XCMS 對數據自動分析處理，XCMS 以 t 檢驗對2組間平均豐度值進行差異統計，以P<0.05 提取差異變量。剔除加合、同位素及碎片離子。并根據相同色譜條件下建立的標準化合物的液質數據驗證化合物的準確性。結合多元統計分析的VIP的大小，大鼠血清和尿液最終在正負離子檢測模式共提取到44個差異性代謝物。

2.3 MetPA代謝途徑分析 將液質聯用篩選出的44個代謝物數據導入MetPA 進行代謝通路查詢。相關 29條通路分析的詳細結果見表1，綜合 Raw p，Holm p，FDR，影響值結果，對與毒性相關代謝通路的重要性進行評價。結果得到5個代謝通路：類固醇激素的生物合成，而戊糖、葡萄糖醛酸轉換，賴氨酸代謝，谷胱甘肽代謝和抗壞血酸代謝因具有較大影響值（>0.3）也被列為潛在的代謝途徑，代謝通路分析見圖2。

3 討論

在本研究中，基于液質聯用代謝組學研究方法， 通過比較金鈴子散高、中、低劑量對大鼠代謝譜差異的影響，識別與毒性相關的代謝物通路，并進行代謝通路分析，見圖3。由代謝網絡圖可以看出，與毒性相關的代謝通路主要和生物體氨基酸代謝、能量轉換及激素代謝有關，這些代謝通路與肝臟線粒體功能相關性很大。

軛合反應指藥物或其代謝物與生物機體的內源性物質相結合，產生極性更強的代謝物，更容易被排出體外，從而達到代謝的目的。葡萄糖醛酸軛合反應負責機體內多種外源和內源性化合物的清除，在多種藥物及其氧化代謝產物、體內毒物、內源性激素、膽酸的代謝清除中發揮著重要作用[4-8]。葡萄糖醛酸轉移酶將葡萄糖醛酸（LC-MS正離子模式579.9）生成葡萄糖醛酸苷產物，減少對目標靶的親和性，增加了其在機體中的排泄，有更強的解毒和去活化作用[9-12]。金鈴子散中劑量組葡萄糖醛酸軛合反應增加，排毒效果增加，而高劑量組含量相對較低，則說明肝腎受損，已不可逆轉。

抗壞血酸（ascorbic acid）是生物體內重要的氧化還原劑，主要參與機體內活性氧的清除和細胞調控， 并作為多個酶的輔因子參與多種生理過程[13-15]?？箟难崮苁惯^氧離子失活，有較為廣泛的抗氧化損傷能力[16-17]。另外抗壞血酸與中性粒細胞內的谷胱甘肽相互作用，可調節細胞內氧化還原狀態，從而使中性粒細胞產生氧自由基減少。金鈴子散組中劑量組谷胱甘肽（LC-MS正離子模式304.1）含量較空白對照組下降，使得細胞抗氧自由基增加，使細胞損傷造成毒性。

類固醇是由機體內分泌腺分泌的親脂性小分子化合物，一般作用于外周靶組織和中樞神經系統[18-19]。孕烯醇酮是所有類固醇激素的母體化合物，可以被氧化異構化成孕酮并經羥基化反應生成其他類固醇激素。當機體受到外界嚴重的應激反應時，下丘腦可產生促腎上腺皮質激素釋放激素，經腺垂體產生促腎上腺皮質激素進而合成和分泌糖皮質激素皮質醇。皮質醇通過對中間代謝，炎癥和免疫應答的作用，使機體對應激起反應，嚴重者造成肝腎毒性損傷[20]。從實驗結果分析顯示，金鈴子散組孕烯醇酮（LC-MS負離子模式329.1）含量升高，皮質醇分泌代謝失衡，影響大鼠體內脂質代謝。

谷胱甘肽是谷胱甘肽轉移酶（GSTs）催化反應中的底物， 在機體中可以有效清除機體內的毒性物質。還原型谷胱甘肽由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成，能氧化分解體內的超氧因子，中和自由基對組織的損壞，防止因巰基氧化而導致的蛋白質變性，抑制細胞凋亡，降低炎癥反應，調節脂質代謝，從而達到降低毒性的作用[21-23]。谷胱甘肽通過還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽互相轉化構成生物體的氧化還原緩沖系統，與親電子基質結合后可清除體內的超氧離子和其他自由基[24-28]。另外，谷胱甘肽還可以通過谷氨酰胺循環途徑維持蛋氨酸的含量，以保證轉甲基及轉丙氨基反應，促進膽酸代謝，從而加快機體受損功能的恢復[29]。當藥物對生物體的肝腎造成損害時，使自由基產生增多，導致谷胱甘肽生成不足，啟動了谷胱甘肽極度缺乏的惡性循環，引起全身性功能的下降與損害如腦、肝和腎等臟器。從實驗結果來看金鈴子散39.4 g·kg-1劑量組谷胱甘肽（LC-MS正離子模式304.1）含量降低，19.7 g·kg-1劑量組谷胱甘肽含量上升，推測高劑量組體內谷胱甘肽代謝調節已經損壞，而低劑量組有一定的調節作用。

賴氨酸在生物體內除了可以合成蛋白質外，還可通過脫氨作用參與三羧酸循環，提供能量。賴氨酸為戊二酰輔酶A脫氫酶的代謝底物，當戊二酰輔酶A脫氫酶不足時，產生賴氨酸代謝障礙，使四氫異喹啉在機體內蓄積[30]。另外在賴氨酸的降解過程中，酵母氨酸途徑是其降解的主要通路[31-33]。與模型對照組相比金鈴子散高劑量組四氫異喹啉（LC-MS正離子模式190）含量升高，推測金鈴子散的毒性作用可能通過增強四氫異喹啉的代謝途徑，影響賴氨酸的代謝途徑，從而作用于線粒體的能量代謝或自由基的產生清除過程，導致氧化應激失衡，造成機體損傷。

本課題采用傳統病理學實驗方法與代謝組學分析技術相結合，對金鈴子散進行毒性機制的探索。從實驗結果來看，金鈴子散各劑量組大鼠對外界刺激反應緩慢，金鈴子散高劑量組給藥后，不同時間段內尿液代謝物表型的聚類分布明顯，且隨給藥時間的延長體內代謝物質的差異性逐漸增大，提示高劑量金鈴子散灌胃給藥后14 d，已經干擾了大鼠體內代謝物的組成，此時已存在潛在毒性。在代謝途徑方面，賴氨酸代謝和谷胱甘肽代謝對大鼠體內毒性的影響最為顯著。從金鈴子散9.85，19.7， 39.4 g·kg-1組的亞急性毒性實驗中觀察發現，金鈴子散19.7，39.4 g·kg-1劑量組可造成明顯的肝腎毒性，9.85 g·kg-1劑量組毒性作用相對較弱。

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