降膽固醇植物乳桿菌I4菌在酸奶中的應用

(西華大學生物工程學院，成都610039)

降膽固醇植物乳桿菌I4菌在酸奶中的應用

朱奇奇，張馳翔，王周，蒲博，焦士蓉

(西華大學生物工程學院，成都610039)

由于降膽固醇植物乳桿菌I4菌具有良好的功能特性，為了更好地發揮其益生作用，對I4菌與商業酸奶益生菌進行復配，利用響應面對復配參數進行優化，并對酸奶21 d內的微生物含量、理化指標和降膽固醇率進行測定。結果表明：以商業益生菌與I4菌粉比例為1∶1，發酵時間10.6 h，發酵溫度40.9℃，蔗糖質量分數8.1%，后發酵時間16 h進行發酵，酸奶感官評分最高。4℃冷藏21 d間乳酸菌數為4.01×109～4.45×109mL-1，pH值為4～4.28、滴定酸度為72～88oT，持水力為73.3%～80%、乳清析出率為2.1%～8.3%，黏度為407～434 mPa·s，硬度為129.96～221.34 g。通過對復配后發酵的酸奶進行降膽固醇能力的測試，得出膽固醇降解率為43.6%±0.82%。

降膽固醇植物乳桿菌；酸奶；響應面優化；

0 引言

發酵乳制品是益生菌最重要的載體之一，益生菌作為附屬發酵劑添加到發酵乳制品中，不僅可以增加發酵乳制品的保健功效，而且還可以改善其品質，賦予其獨特的風味[1]。作為食物的添加劑，益生菌還能夠增強食品的健康特性，提高產品的消費價值。目前投入市場的益生菌發酵乳制品種類很多，其中包括：含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、酸豆奶以及含多種益生菌的口服液、片劑、膠囊、粉末劑等[2]。

本研究試驗菌株L.plantarum I4由四川泡菜中分離得到，經研究表明該菌株具有良好的耐酸性及膽鹽耐受性，對免疫系統具有顯著的調節功能[3]；經體外試驗表明，該菌株具有較好的抗氧化作用及降膽固醇功效[12]。因此，本章研究的目的在于通過與商業用酸奶益生菌進行復配，并對乳中發酵特性進行評價，為進一步開發益生菌發酵劑奠定基礎。

1 實驗

1.1材料與儀器

降膽固醇植物乳桿菌I4菌，新希望純牛奶，蔗糖，益生優酸奶益生菌，鄰苯二甲醛，膽固醇。

電熱恒溫隔水式培養箱，UV-2600型紫外可見分光光度計，PEN3電子鼻，NDJ-5S旋轉黏度計，TA-XT plus質構儀。

1.2方法

1.2.1 酸奶的發酵工藝

純牛奶→添加白砂糖→接種→混合均勻→發酵→冷藏后熟（4℃）→發酵乳→檢驗分析

1.2.2 響應面優化實驗設計

通過單因素實驗（未發表），探討各因素在酸奶口感的影響大小。以感官評定指標為響應值，選發發酵時間、發酵溫度以及蔗糖濃度這3個作用最顯著的因素，在發酵粉與I4菌粉比例為1∶1、后發酵時間16 h的條件下。設計Box-Behnken實驗。采用Design Expert8.05 b軟件輔助實驗，實驗因素水平及編碼值如表1所示。

表1 Box-Behnken設計實驗因素水平及編碼

1.2.3 感官指標評定

由本實驗室成員成立一個15人感官評定小組，經過對酸奶感官評定課程的培訓，基本掌握酸奶的感官分析方法。評分標準采用百分制。對酸奶樣品的芳香味、氣味、口感、表觀以及黏稠度進行打分，評定標準如表2所示[4]。

表2 酸奶感官評分

1.2.4 酸奶樣品的微生物及理化測定

利用單因素試驗優化的工藝參數生產酸奶,發酵結束后在貯藏溫度為4℃的條件下貯藏。分別在酸奶樣品冷藏期的第1，7，14，21 d取樣，進行微生物和理化指標的測定。

⑴微生物指標測定。采用GB 478935-2010的方法測定乳酸菌的菌落數。

⑵理化指標測定。

①pH測定采用PHS-3C型精密pH計測定樣品的pH值。

②滴定酸度的測定根據國標GB 541334-2010測定。

③持水力的測定。菌株持水能力采用KEOGH[6]等研究方法，并略作改動。取發酵乳樣品5.0 g，離心（3 000 g，10 min）。收集上清液稱重。按下列公式計算酸奶的持水性：

持水能力（%）=（沉淀重g/樣品重量g）×100%

④自發乳清析出情況。酸奶自4℃冰箱取出后，稱酸奶質量（W1），而后將酸奶杯傾斜45°，10 s內吸出表面的乳清，再稱取酸奶的質量（W2）。酸奶杯與膜質量記為（W0）。

自發乳清析出=(W1-W2)/(W1-W0)

⑤凝膠強度和黏度的測定。將酸奶樣品于室溫(25℃)下回復一段時間，選用錐形探頭36 R，下壓模式，穿入未經攪拌的酸奶，插入深度15 mm，下降速度與測試速度為1.0 mm/s，提升速度為2.0 mm/s，測試深度15.0 mm，記錄探入過程中所需的應力（g）[7]。此過程所需最大的力即為酸奶的凝膠強度[8]，每個樣品重復測定3次，取平均值。

將酸奶樣品于室溫(25℃)下回復一段時間，用玻璃棒順時針、逆時針各攪拌20下，使酸奶樣品均勻，選用LV3轉子，轉速60 r/min，測試時間1 min，每隔5 s取一個測試值，測定攪拌后的酸奶黏度。

發酵酸奶降膽固醇能力的測定參考文獻[9-12]。

2 結果與分析

2.1響應面實驗結果及分析

選取對酸奶感官質量影響較大的發酵時間、發酵溫度以及蔗糖濃度這3個因素做Box-Behnken設計，并且以感官質量評分作為響應值，設計及結果如表3所示。

表3 Box-Behnken設計及結果

利用Design Expert 8.05 b軟件對上述數據進行分析，得回歸模型方差分析，結果如表4所示。

對表4回歸模型方差分析，實驗所選用模型P值＜0.0001，極顯著，說明不同因子與響應值之間的線性關系是極顯著的，同時試驗方法也是可靠的。失擬項P值為0.146，不顯著(P＞0.05)，說明該方程對實驗擬合情況好，可用該方法對各因素條件下的酸奶感官進行預測。本研究R2=0.9771，即響應值有97.71%來源于所選變量的變化，也即該方程擬合度好。變異系數為2.78，說明實驗可靠性良好

表4 回歸模型方差分析

三個因子經過擬合，得到二次多項回歸方程為

R=86.40+6.50A+3.50B+0.50C+0.50AB-0.50AC+ 0.50BC-11.45A2-4.45B2-6.45C2。

根據回歸方程作出不同因子的響應面分析圖，如圖1～圖3所示。

圖1 發酵時間和發酵溫度對酸奶感官評分的影響

圖1為在蔗糖質量分數為8%時，發酵時間和發酵溫度對酸奶感官評分的交互影響效應。由圖1可以看出，發酵溫度對酸奶感官評分影響較小，表現為曲線較平滑，而發酵時間的影響則較大，表現為曲線較為陡峭。發酵時間的等高線較密，說明發酵時間與發酵溫度對酸奶感官評分的交互效應比較顯著。

圖2 發酵時間和蔗糖濃度對酸奶感官評分的影響

圖2為發酵溫度40℃時，發酵時間與蔗糖質量分數對酸奶感官評分的交互影響。由圖2可以看出，發酵時間對酸奶感官評分影響較大，表現為曲線較陡峭，同時也可看到，這兩者的交互影響較為顯著。

圖3 發酵溫度和蔗糖質量分數對酸奶感官評分的影響

圖3為發酵時間10 h的情況下，發酵溫度與蔗糖質量分數對酸奶感官評分的交互影響。由圖3可以看出，說明發酵溫度對酸奶感官評分影響較大，表現為曲線較陡峭。這兩者的交互影響較為顯著。同時，這也與圖2的結論一致。發酵溫度和蔗糖質量分數對酸奶感官評分的影響比較，發酵溫度影響較為顯著，等高線更接近發酵溫度。

2.2最佳工藝的預測和驗證

通過輔助軟件Design Expert，優化發酵條件。得到理論最佳發酵條件和響應數據為，發酵時間10.6 h，發酵溫度40.9℃，蔗糖質量分數8.1%。進行驗證實驗，得到實驗結果為89。根據回歸方程，計算得其感官評分預測值為88.0532。相對誤差為1.1%（小于10%）。證明響應面優化酸奶工藝是可行的。

2.3微生物指標

酸奶樣品在1，7，14，21 d活菌數檢測結果如表5所示。

表5 不同天數活菌數檢測結果 mL-1

由表5可知，經4℃冷藏，乳酸菌的活菌數隨著冷藏時間的延長先增加后降低，在7 d時達到最大為4.45×109cfu mL-1，隨后開始降低，21 d時為 4.01× 109cfu mL-1。遠高于GB 19302-2010要求的乳酸菌數大于等于1×106cfu mL-1，表明乳酸菌在酸乳冷藏期間的存活能力較強。本研究中所選用的植物乳桿菌I4菌按1∶1的添加量與商業發酵劑益生優酸奶益生菌復配制備的酸奶在4℃冷藏21 d后，其活菌數達到了4.01×109cfu mL-1，符合GB 19302-2010要求。

2.4理化指標

2.4.1 pH值與滴定酸度

由圖4可以看出，4℃冷藏21 d期間，兩樣品的pH值隨天數的增加呈下降趨勢，而滴定酸度呈上升趨勢。添加了L.plantarum I4的酸奶樣品中，其pH值和滴定酸度與樣品相比在各個階段差異均不顯著(P＞0.05)，這可能是由于L.plantarum I4在乳中產酸能力較差的原因，進而表明添加L.plantarum I4對酸奶冷藏期間的pH值與滴定酸度沒有太大影響，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趨勢。符合國標GB 19302-2010。

圖4 冷藏期間pH值、滴定酸度變化情況

2.4.2 持水力變化

持水力是酸奶的重要理化指標之一，它的大小直接影響著酸奶的組織狀態。酸奶樣品持水性越好，酸乳凝膠體系中束縛水的含量就越多，在不破乳的情況下更能保持產品較好的風味和氣味，使產品口感更佳。酸奶的持水力變化如圖5所示。

圖5 冷藏期間持水率變化情況

由圖5可以看出，酸奶樣品在冷藏期間都表現出了很好的持水力。由圖5可知，兩組酸奶樣品在冷藏期間都表現出了很好的持水力，含有L.plantarum I4酸奶樣品的持水能力略低于商業發酵劑樣品，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 自發乳清變化、硬度和黏度的變化

由圖6～圖8可以看出，L.plantarum I4對酸奶樣品的凝膠強度和黏度無顯著影響。添加了L.plantarum I4的樣品的凝膠強度略高于商業發酵劑的樣品，黏度略低于商業發酵劑的樣品，但差異均不顯著(P＞0.05)，兩組樣品均在冷藏7 d時凝膠強度達到最大值，在7 d后硬度呈下降趨勢。樣品的黏度和乳清析出率在1～14 d冷藏期呈上升趨勢，在14 d后黏度最大，乳清析出率基本不變，到21 d時黏度稍微下降，可能是因為冷藏至21 d時，酸奶的自發乳清析出比較多，導致黏度下降。

圖6 冷藏期間自發乳清析出變化情況

圖7 冷藏期間酸奶硬度的變化情況

2.5酸奶降膽固醇能力測定

圖8 冷藏期間酸奶黏度變化情況

通過對酸奶中降膽固醇能力的測試，得出復配優化后酸奶對膽固醇降解率為43.6%±0.82%（n=3），商業用益生優酸奶益生菌發酵酸奶對膽固醇降解率為14.3%±0.9%（n=3），說明通過復配優化后做益生性發酵酸奶中具有顯著的降膽固醇效果。

3 結論

（1）通過Box-Behnken響應曲面法實驗，確定了益生性酸奶的的最佳試驗條件為：優化發酵條件得到理論的最佳的發酵條件和響應數據為，發酵粉與I4菌粉比例為1∶1，發酵時間10.6 h，發酵溫度40.9℃，蔗糖質量分數8.1%，后發酵時間16 h。

（2）對響應面優化后的益生性酸奶進行微生物測定，經4℃冷藏，乳酸菌數21 d內為4.01×109～4.45× 109mL-1，符合GB 19302-2010要求。

（4）對響應面優化后的益生性酸奶進行理化測定，4℃冷藏21 d期間，酸奶的pH值隨天數的增加呈下降趨勢，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趨勢。符合國標GB 19302-2010。4℃冷藏21 d期間持水力為73.3%～80%，乳清析出率為2.1%～8.3%，黏度為407～434 mPa·s和硬度為129.96～221.34 g。表明L. plantarum I4對酸奶樣品的滴定酸度、凝膠強度、持水力等均無不良影響（P＞0.05），所以將其作為附屬菌應用到酸奶生產中具有極大的可行性。

（4）通過對酸奶中降膽固醇能力的測試，得出復配優化后酸奶對膽固醇降解率為43.6%±0.82%（n=3），商業用益生優酸奶益生菌發酵酸奶對膽固醇降解率為14.3%±0.9%（n=3），說明通過復配優化后做益生性發酵酸奶中具有顯著的降膽固醇效果。

[1]郭壯,王記成,閆麗雅,等.益生菌Lactobacillus casei Zhang對酸奶風味、質地及感官特性的影響[J].中國乳品工業,2009,37(1):14-20.

[2]董成.益生菌L.caseiZhang在干酪中的應用研究[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2008.

[3]楊貞耐,李盛鈺,張雪等.一株具有降膽固醇功能的植物乳桿菌及其應用[J].中國,CN101864375A,2010.10.20.

[4]于志會.益生性降膽固醇植物乳桿菌的篩選、發酵特性及體內功效研究[D],長春:吉林大學,2013.1-95

[5]FU M L,CHIU H,TZU M P.Fermentation of a milk-soymilk and Lycium chinense Millermixture using a new isolate ofLactobacillus paracaseisubsp.paracaseiNTU101 andbifidobacterium longum[J].Journal of Industrial Mi-crobiology&Biotechnology,2004,31:559-564.

[6]KEOGH M K,O’KENNEDY B T.Rheology of stirred yogurt as affected by added milk fat,protein and hydrocolloids[J].Journal of Food Science,1998,63(1):108-112.

[7]李春紅,張明晶,潘家榮.物性測試儀在黏稠類食品品質評價上的應用研究[J].現代科學儀器,2006,6:111-113.

[8]HESS S J,ROBERTS R F,ZIEGLER G R.Rheological properties of nonfat yogurt stabilized using Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus producing exopolysaccharide or using commercial stabilizer systems[J]. Journal of Dairy Science,1997,80(2):252-263.

[9]MATHARA J,SCHILLINGER U,GUIGAS C,et al.Functional characteristics of Lactobacillus spp.from traditional Maasai fermented milk products in Kenya[J]．International Journal of Food Microbiology，2008,126(1/2):57-64.

[10]LIM H J，KIM S Y，LEE W K．Isolation of cholesterol—lowering Lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use[J].Veterinary Science,2004,5(4):39l-395.

[11]HARDER J,PROBIAN C,Anaerobic mineralizationi of cholesterol by a novel type[J].Archives of Microbiology,1997,167:269-274.

[12]朱奇奇,蒲博,王周,等.一株降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及在發酵泡菜中的應用[J].中國調味品,2016,41(5)：16-22.

Study on the application of I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria in yogurt

ZHU Qiqi,ZHANG Chixiang,WANG Zhou,PU Bo,JIAO Shirong
（School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China）

I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria has good functional properties,in order to better play a role of prebiotics,to compound with I4 bacteria and commercial probiotic bacteria of yogurt,Using response surface methodology to optimal the composited parameters.We also measured the microbial content,physical and chemical index and the rate of cholesterol-lowering of yogurt within 21 days. The result shows that the optimal sensory properties of fermentation yogurt with commercial probiotics bacteria and I4 bacteria ratio of 1∶1, fermentation time 10.6 h,fermentation temperature 40.9℃,sucrose concentration 8.1%,after fermentation 16 h.4℃ refrigerated within 21 days，the number of Lactic acid bacteria is 4.01×109～4.45×109mL-1,pH is 4～4.28,titratable acidity is 72～88oT,water-holding power is 73.3%～80%,whey separation rate is 2.1%～8.3%,viscosity is 407～434 mPa·s,hardness is 129.96～221.34 g.The test of the cholesterol-lowering ability of fermented yogurt of optimal composited parameters indicates rate of 43.6%±0.82%.

cholesterol-lowering plant Lactobacillus;yogurt;response surface methodology

TS252.1；TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0012-05

2016-09-13

西華大學省級重點試驗室開放研究基金項目（szjj2014-009)；教育部春暉計劃（12205543）；西華大學研究生創新基金資助（ycjj2015025)。

朱奇奇(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為食品領域。

焦士蓉