橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達的影響研究

陳明喆 何偉

·論著·

橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達的影響研究

陳明喆 何偉

目的 研究橙皮苷對IgA 腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達的影響，探討橙皮苷對腎臟是否有保護作用及其作用機理。方法 雄性SD大鼠60只隨機分為正常組、模型組和橙皮苷治療組，IgA模型建立成功后，橙皮苷治療組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治療，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，治療4周后、8周后分別處死大鼠，檢測其24小時尿蛋白、血尿素氮、血白蛋白、白介素-1(interleukin-1，IL-1)和白介素-6 (IL-6)，免疫組化、RT-PCR以及Western blot檢測腎組織中TLR-4和NF-κB表達。結果 在整個實驗過程中，正常組飲食正常，精神良好，模型組和橙皮苷治療組在造模成功后表現有一定的食欲不振和精神萎靡，使用橙皮苷治療后，上述情況有所緩解；與正常組相比，模型組24小時尿蛋白、血尿素氮、IL-1和IL-6明顯升高(P<0.05)，白蛋白明顯下降(P<0.05)，治療4周后，上述指標有明顯改善，治療8周后其基本和治療4周后一致；RT-PCR、Western blot和免疫組化可見，相較于正常組，模型組TLR-4和NF-κB蛋白及mRNA表達明顯增加(P<0.05)，橙皮苷治療4周后，其有明顯降低，治療8周后，表達更弱(P<0.05)。結論 橙皮苷可明顯下調TLR-4和NF-κB的表達，進而降低炎癥反應，改善腎功能，最終保護腎臟組織。

橙皮苷； IgA腎??； Toll樣受體4； 自然細胞殺傷因子-κB

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是臨床中最為常見的一種腎小球原發性疾病，本病多見于青少年兒童，其臨床主要表現為反復發作的血尿以及不同程度的蛋白尿[1]。由于本病多和自身免疫力相關，所以在發病前長伴有一定的上呼吸道病史，此外本病預后良好，但是在臨床中仍有25%到30%的患者預后不理想，進而發展為終末期腎病[2]。對于本病的治療西藥多以激素治療為主，而中草藥在治療此病時具有很好療效，但是中草藥在向國際推廣時，面臨著藥物成分復雜，藥理作用不明確的尷尬境地，所以采用現代化思維來研究中藥是具有實踐意義的[3]。橙皮苷是從橙皮中提取的一類苷類化合物，本次研究用橙皮苷治療IgA腎病大鼠，觀察治療后其腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達特點，以明確橙皮苷是否可以緩解IgA腎病大鼠癥狀以及其治療機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本次實驗共購買SD大鼠60只，所有大鼠均購于華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，大鼠體質量為180～200 g，所有大鼠購買后均給予定時定量飲水，同時勤換墊料的基礎上適應性喂養2周，2周后開始構建IgA腎病模型。

1.1.2 主要試劑和材料 本次藥物橙皮苷購于湖北合天化工有限公司；造模用試劑牛血清蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)以及四氯化碳(CCl4)購于中國國藥公司；造模用花生油購于山東魯花有限公司；造模用蓖麻油購于上?；瘜W有限公司；TLR-4抗體，NF-κβ抗體購于英國abcam公司，總RNA提取試劑盒購于天根生物公司，引物合成由南京金斯瑞生物工程公司完成。

1.2 動物模型的建立以及分組

所有大鼠在造模前均給予一次檢測血液腎功能，腎功能沒有異常后開始分組和造模，60只大鼠采用隨機原則分為正常對照組、模型對照組(IgA腎病組)，以及橙皮苷治療組，每組為20只，模型對照組和橙皮苷治療組在分組后即給予造模，造模按照經典方法進行[4]，首先每天給予1次牛血清蛋白灌胃，灌胃量為400 mg/(kg·d)，共灌胃10周；大鼠每周注射一次0.5 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周；分別于第6周后、第8周后給予大鼠脂多糖0.05 mg尾靜脈注射；為使實驗準確，在造模時正常對照組每天給予等量的生理鹽水灌胃，注射也為等量生理鹽水，10周后，觀察其造模成功，造模成功的判斷標準為：可見明顯血尿以及鏡下檢測可發現有30%的紅細胞。

1.3 大鼠治療方法

大鼠在造模成功后開始治療，橙皮苷治療組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治療(10 mg橙皮苷溶于1 mL的生理鹽水中)，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，分別于治療4周后、8周后處死大鼠，進行下述實驗。

1.4 組織提取方法

大鼠處死時采用3%的戊巴比妥麻醉，麻醉后沿腹中線切開大鼠腹部，首先從心尖處取血，取血后立即離心，離心速度為4000 rpm，離心后提取上清液置于超低溫冰箱保存備用檢測(-86℃)，之后迅速取出腎臟，統一取左側腎臟切取十分之一置于10%的中性福爾馬林溶液中保存，其余置于超低溫冰箱保存備用(-86℃)。

1.5 生化指標檢測

大鼠生化指標的檢測采用全自動生化儀完成，檢測指標為24小時尿蛋白定量、血尿素氮以及白蛋白，炎性因子白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)和IL-6的檢測采用Elisa試劑盒，試劑盒購于武漢bio-sweap公司，檢測方法為雙抗體夾心法。

1.6 免疫組化

本次檢測用免疫組化法檢測大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達具體方法如下：(1)首先將多聚甲醛固定好的腎臟組織取出，酒精梯度脫水后將其置于融化的石蠟組織中進行包埋，包埋后進行切片，切片厚度為3～5 μm，之后將切片置于60℃恒溫箱中烘烤20分鐘；(2)烘烤后將組織進行脫蠟、之后用PBS洗滌3次，每次5分鐘；(3)上述完成后采用3%的雙氧水浸泡，浸泡后洗滌，洗滌完成后修復抗原，之后加入相應一抗、二抗后，DAB顯色，顯色后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色程度以及蛋白的表達位置。

1.7 腎組織TLR-4和NF-κB mRNA的檢測

腎組織TLR-4和NF-κB mRNA的檢測采用半定量RT-PCR法，具體為稱取30 mg腎臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取后定量調平，之后行逆轉率以及擴增反應，引物設計為TLR-4，上游：5′-GGCGAGCGTCATGTACACACAAC-3′，下游：5′TGGAAAGCCGACGCAGACGCTGC-3′，產物長度為296 bp；NF-κB上游：5′CTCGAAATACTCACAAGGTCCCGGCGAT-3′，下游：5′ AC GGTACAACGAGTAAAGAAGAC-3′，產物長度為296 bp；內參為β-actin，其中上游為：5′CAGGCGTAAGCTCCGCCACTTCCGTAT-3′，下游為：5′GGCCGGCACCAAGCTTCTTCGGTAC，產物長度為521 bp。反應條件為94℃預變性2分鐘，之后同樣溫度變性30秒，48.6℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個循環；最后再延伸5分鐘。完成后每組各取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完成后采用凝膠成像儀照片，并分析電泳帶灰度值，全組以β-actin為內參，每組實驗重復3次。

1.8 TLR-4和NF-κB蛋白表達的檢測

腎組織TLR-4和NF-κB蛋白質的表達檢測采用Western blot法，首先用總蛋白提取試劑盒提取腎臟組織中總蛋白，之后總蛋白用BCA法定量，定量后立即給予調平，再測定一次后進行下述實驗，首先設置好實驗分組，之后每組各取50 μg進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后切取目標蛋白，之后將其立即轉移到PVDF膜上(美國Santa公司)，轉移后用脫脂牛奶封閉2小時洗滌3次后加入一抗，洗滌3次，之后加入二抗洗滌3次，洗滌完成后進行ECL熒光照片，全組實驗以β-actin作為內參，凝膠成像儀分析系統掃描并定量膠片條帶灰度值，每組實驗重復3次。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況

在分組前所有大鼠飲食均正常，同時皮毛光滑有明顯的光澤，而造模成功后，模型組和橙皮苷治療組大鼠活動明顯減少，同時精神萎靡，毛色發黃，橙皮苷開始治療后，皮毛等明顯有好轉，飲食和飲水也有明顯改善，精神活動雖有一定改善，但不明顯。

2.2 腎功能相關指標

由表1可見，模型組與對照組相比，血尿素氮和24小時尿蛋白明顯升高(P<0.05)；白蛋白明顯降低，橙皮苷治療4周，血尿素氮和24小時尿蛋白均明顯降低(P<0.05)，白蛋白明顯升高，治療8周后，上述指標進一步改善(P<0.05)。

表1 治療4周后和8周后大鼠腎功能基本指標評價

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3 血清IL-1和IL-6的測定

與正常組比較，模型組大鼠IL-1和IL-6明顯升高(P<0.05)。橙皮苷治療4周后，其水平較模型組均明顯下降(P<0.05)，治療8周后進一步降低。詳見表2。

表2 治療4周后和8周后大鼠血清中IL-1以及IL-6含量變化

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4 免疫組化

免疫組化可見，正常對照組只有少量的NF-κB和TLR-4分泌(圖中褐色部分所見)，模型組NF-κB和TLR-4明顯增高，橙皮苷治療后上述兩個指標分泌均明顯下降，治療8周后下降更明顯，詳見圖1和圖2。

圖1 大鼠腎臟組織中NF-κB免疫組化圖

圖2 大鼠腎臟組織中TLR-4免疫組化圖

2.5 蛋白表達

與正常組相比，模型對照組NF-κB和TLR-4蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，治療4周后NF-κB和TLR-4明顯降低(P<0.05)，治療8周后基本和治療4周后一致，詳見圖3和表3。

2.6 mRNA表達

與正常組相比，模型對照組NF-κB和TLR-4的mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，治療4周后NF-κB和TLR-4明顯降低(P<0.05)，治療8周后基本和治療4周后一致，詳見圖4和表4。

圖3 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的蛋白表達

表3 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的蛋白的相對表達量

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

圖4 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的mRNA表達

表4 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的mRNA的相對表達量

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討論

IgA腎病簡而言之就是一種以血清中IgA明顯升高，造成其在腎臟中過度聚集，進而引發病變的一種病癥[5]。目前已有大量的研究顯示[6-8]，IgA腎病與遺傳和基因表達異常密切相關，是典型的免疫系統疾病。單純的降低免疫反應危害較大，非急性患者使用會帶來很多不良反應，而目前西藥治療本病沒有特效藥，因此積極研究和開發治療本病的藥物是十分必要的。已有的研究表明，IgA免疫球蛋白的異常增高可以造成其在腎臟的沉積，而沉積最主要的危害就是引起腎臟炎癥反應，這種炎癥反應必須積極消除，否則會反作用于已經受損的腎臟，造成其后續并發終末期腎炎、腎臟衰竭等[9]。因此治療本病的原則除降低免疫反應外，依靠藥物降低免疫炎癥介質，使其不易在腎臟中沉積是治療本病的一個方向。

橙皮是經典中藥材之一，其價格便宜但效果較好，臨床中多用其配合其他中藥材合用，具有化痰理氣、健脾導滯等疾病，此外其還可以用于治療感冒咳嗽，食欲不振，胸腹脹痛以及腸鳴便瀉等[10-11]，橙皮苷是從橙皮中提取的一類化合物，研究顯示橙皮苷具有維持患者滲透壓、增強患者毛細血管的韌性、降低膽固醇等方面作用，而近年來關于其可以調節腎功能，改善一些腎病也有文獻報道[12]，但是目前關于其是否可以治療IgA腎病還沒有文獻報道，本次采用經典造模法構建IgA腎病模型，該造模方法雖然造模時間長，但其主要作用為破壞大鼠免疫能力，因此將其用于IgA腎病發生后的研究是有意義的，研究顯示，與正常組相比，模型組24小時尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明顯升高(P<0.05)，白蛋白明顯下降(P<0.05)，治療4周后24小時尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明顯降低，白蛋白明顯升高，而治療8周后，上述指標基本與治療4周后一致，這提示橙皮苷對IgA腎病大鼠短期內具有一定的調節作用，但是遠期效應一般。

白介素1和白介素6的降低表明其對炎癥反應具有很好的調節作用，但具體是哪種酶的調節還需明確，由于炎癥反應首先發生于IgA免疫蛋白集結于腎病后，因此降低炎癥反應說明其可以緩解IgA腎病的進展，臨床中TLRs是既參與免疫反應又參與炎癥反應的重要因子，本因子可在肝臟、腎臟、脾以及肺中廣泛表達，進而介導炎癥反應，其靶向介導炎性因子較多，其中激活轉錄因子NF-κB是最為直接的一環，NF-κB是炎癥反應最典型介質之一，其可以殺傷壞死的細胞，但是在殺傷的同時也會激活大量炎癥因子，諸如IL-1和IL-6，最終影響免疫和炎癥反應[13-16]。本次研究采用免疫組化、Western blot以及RT-PCR重點觀察其治療后NF-κB和TLR-4表達明顯降低，這提示橙皮苷對IgA腎病具有很好的調節作用。

綜合提示：橙皮苷可明顯下調IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達，進而降低炎癥反應，改善腎功能，最終保護腎臟，但其調控炎癥反應遠期效應較差，具體原因仍有待于后期研究進行。

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(本文編輯： 董歷華)

Effect of hesperidin on TLR-4 and NF-κB in kidney tissue of IgA nephropathy rats

CHENMingzhe，HEWei.TheNephrologyDepartmentofHuangshiCentralHospital，Huangshi435000，China

Correspondingauthor：HEWei，E-mail：hsyiyuantougao@163.com

Objective To study the effect of hesperidin on TLR-4 and NF-kB in IgA nephropathy rats，and discuss whether hesperidin have the protective effect to kidney and its protection mechanism. Methods 60 male SD rats were randomly divided into normal group，model group and hesperidin treatment group，after the IgA model was successfully established，hesperidin treatment group was given hesperidin (10 mg/kg·d) to lavage treatment，the normal group and model group was given equal saline lavage，and after 4 weeks and 8 weeks of treatment, rats were sacrificed to detect the 24h urine protein，serum BUN，blood albumin，interleukin 1 and interleukin-6，immunohistochemistry，RT-PCR and Western Blot was used to detect the expression of TLR-4 and NF-κB in renal tissue. Results In the process of the whole experiment，the normal group was fed with normal diet and the spirit was good，model group and the hesperidin group has certain anorexia and depression after molding， the above situation was improved after using hesperidin; Compared with normal group，model group in 24h urinary protein，serum BUN，interleukin-6 and interleukin-1 rise obviously，albumin was significantly lower，after 4 weeks of treatment，those indices were improved significantly，results of 8 weeks and 4 weeks of treatment were basically the same; Compared with normal group，TLR-4 and NF-kB protein and mRNA expression in model group were significant increased，after 4 weeks of treatment of hesperidin, these indices were significantly reduced，after 8 weeks of treatment，the expression was more less (P<0.05). Conclusion Hesperidin can obviously decrease the expression of TLR-4 and NF-kB and inflammatory reaction，it also can improve renal function，eventually to protect kidney.

Hesperidin； IgA nephropathy； Toll-like receptor 4； NF-κB

435000 黃石中心醫院自籌項目(2014HS023)

鄂東醫療集團黃石市中心醫院腎內科(陳明喆)，老年病科(何偉)；湖北理工學院醫學院(何偉)

陳明喆(1981- )，碩士，主治醫師。研究方向：中西醫結合治療老年病。E-mail：12616918@qq.com

何偉(1980- )，碩士，主治醫師，講師。研究方向：中西醫結合治療腎病。E-mail：hsyiyuantougao@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.002

2016-07-09)