附子對高糖刺激下施萬細胞中Krox20-Oct6信號通路及其調控的髓鞘蛋白的影響

呂甜甜 王宏亮 邢瑋 吳晏 王偉 張子劍 韓靜

·論著·

附子對高糖刺激下施萬細胞中Krox20-Oct6信號通路及其調控的髓鞘蛋白的影響

呂甜甜 王宏亮 邢瑋 吳晏 王偉 張子劍 韓靜

目的 觀察附子對高糖培養下施萬細胞中Krox20-Oct6途徑及其調控的髓鞘蛋白的影響，以揭示附子治療糖尿病周圍神經病變的機制。方法 將施萬細胞分為以下6組：(1)正常組(低濃度葡萄糖)；(2)對照組(甘露醇)；(3)模型組(高濃度葡萄糖)；(4)附子水提物高、中、低劑量組(10 μg/mL,1.0 μg/mL,0.1 μg/mL)。常規培養3天后，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的Oct6和Krox20蛋白的表達水平，采用免疫熒光法檢測各組細胞的髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z蛋白的表達水平。結果 PCR結果顯示，與正常組相比，模型組中Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表達水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表達水平上升。Western blot結果證明，與正常組相比，模型組中Oct6蛋白、Krox20蛋白表達水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中Oct6蛋白、Krox20蛋白表達水平上升。免疫熒光結果提示，與正常組相比，模型組中髓鞘堿性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表達水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中髓鞘堿性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表達水平上升。結論 高濃度葡萄糖通過抑制Krox20-Oct6途徑使施萬細胞髓鞘蛋白生成能力下降，而附子可能通過Krox20-Oct6途徑促進髓鞘蛋白的形成，從而改善糖尿病周圍神經病變。

糖尿病周圍神經病變； 附子； 施萬細胞； Krox20-Oct6信號通路

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病常見的并發癥[1]，常見癥狀有神經傳導速度減慢和溫度感覺異常，病理特征主要為神經軸突萎縮以及髓鞘的受損[2-3]。DPN的作用機制尚未明確，臨床藥物應用具有其自身的局限性，因此亟需探索新的作用機制以及新的藥物治療方法。

附子為毛茛科多年生草本植物烏頭的子根加工品，味辛、甘、大熱，有毒，具有回陽救逆、散寒止痛等功效[4-5]。本課題組前期研究表明附子可以改善糖尿病大鼠神經傳導障礙，縮短糖尿病大鼠的熱板潛伏期[6]，提示附子可能對DPN具有治療作用，但是其作用機理尚未得以揭示。施萬細胞是髓鞘形成的一部分，在髓鞘受損時，施萬細胞進行分化，參與髓鞘的再生[7]。生理狀態下，Krox20-Oct6信號通路在髓鞘形成過程是核心環節，調節髓鞘蛋白的生成[8]。本實驗擬觀察在高糖培養下施萬細胞中Krox20-Oct6信號通路及其調控的髓鞘蛋白的變化，探討附子對Krox20-Oct6信號通路的影響，從而為深入闡述附子的藥理作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑

附子飲片(四川江油,編號20110728)；DMEM培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；0.05%胰蛋白酶(Solarbio公司)；一抗和HRP標記的山羊抗兔IgG均購買于abcam公司；DAPI(Sigma公司)；FITC標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物技術有限公司)。

1.2 細胞株

RSC96細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.3 主要儀器

CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；核酸蛋白檢測儀(美國Quawell公司)；蛋白垂直電泳和轉膜系統、凝膠圖像分析系統、PCR儀、熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)。

1.4 附子單味藥水提物的制備

采用道地產地四川江油附子飲片，取適量置于提取容器中，加入10倍量水，回流提取，過濾，藥渣加8倍量水，回流提取，過濾，合并濾液，濃縮，得到附子水提取物。

1.5 細胞培養和分組

采用貼壁細胞培養的方法，培養基為含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養基(內含1%的青霉素和鏈霉素)，培養環境為5%的CO2，37℃，飽和濕度，2～3天換液一次。

實驗分組：(1)正常組：DMEM基礎培養基；(2)對照組：DMEM基礎培養基+50 mm甘露醇；(3)模型組：DMEM基礎培養基+50 mm葡萄糖；(4)附子高劑量組：10 μg/mL附子DMEM基礎培養基+50 mm葡萄糖；(5)附子中劑量組：1 μg/mL附子DMEM基礎培養基+50 mm葡萄糖；(6)附子低劑量組：0.1 μg/mL附子DMEM基礎培養基+50 mm葡萄糖。1.6 實時定量PCR法檢測Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、髓鞘蛋白Z(myelin protein zero, MPZ)的表達水平

常規方法提取RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，使用Nanodrop 2000測量RNA濃度，然后反轉錄合成cDNA。依據NCBI GenBank中提供的Oct6、Krox20、MBP和MPZ的mRNA序列，引物序列見表1。按以下反應體系：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 5μL；DEPC水3.4μL；上游引物0.3μL，下游引物0.3μL；cDNA 1μL。PCR擴增反應條件：50℃ 2分鐘；95℃ 10分鐘；95℃ 15秒；60℃ 60秒(40個循環)。以β-actin作為內參，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列

1.7 Western blot檢測Oct6及Krox20蛋白的表達

細胞加入RIPA裂解液，充分裂解后，離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜，TBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉2小時，TBST漂洗3次，加入一抗4℃孵育過夜；然后TBST漂洗，再加入二抗，室溫2小時；采用ECL試劑盒檢測。使用Image Lab軟件分析條帶灰度，采用目的蛋白/β-actin的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.8 免疫熒光檢測MBP及MPZ蛋白表達

制備細胞爬片，4%的多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100打孔，加入正常血清封閉，滴加適當稀釋的抗體，置濕盒中4℃過夜，滴加熒光二抗(1∶50稀釋)，37℃孵育30分鐘，加入DAPI染核5分鐘，蒸餾水終止反應，甘油封片。使用激光共聚焦顯微鏡FV1000觀察細胞，DAPI的激發波長為405 nm，發射波長488 nm；FITC的激發波長488 nm，發射波長519 nm。采用Image J軟件分析熒光強度，以其他各組相對于正常組熒光強度的倍數表示MBP或MPZ的蛋白表達水平。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 附子對MBP及MPZ基因及蛋白水平的影響

PCR結果顯示，與正常組比較，模型組MBP基因的含量降低(P<0.05)；同時，與模型組比較，附子高劑量組MBP基因含量增加(P<0.01)，附子低劑量組MBP基因含量增加(P<0.05)；另外，模型組的MPZ基因含量較正常組降低(P=0.051)，但差異無統計學意義，附子不同劑量組MPZ基因含量較模型組升高(P<0.01)。見表2。

表2 附子對MBP及MPZ基因表達水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

免疫熒光結果顯示，與正常組比較，模型組MBP的蛋白水平表達降低(P<0.01)，模型組MPZ的蛋白水平表達降低(P<0.05)；同時，與模型組比較，附子不同劑量組MBP的蛋白水平表達升高(P<0.01)；與模型組比較，附子高劑量MPZ的蛋白水平表達升高(P<0.05)，附子低劑量組MPZ的蛋白水平表達升高(P<0.01)。見圖1、2及表3。

2.2 附子對Krox20及Oct6基因及蛋白水平的影響

PCR結果顯示，與正常組比較，模型組Krox20及Oct6的基因的含量降低(P<0.01)；與模型組比較，附子不同劑量組Krox20及Oct6基因的含量增加(P<0.01)。見表4。

圖1 附子對MBP蛋白表達水平的影響(免疫熒光，×600)

圖2 附子對MPZ蛋白表達水平的影響(免疫熒光，×600)

表3 附子對MBP及MPZ蛋白表達水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，

dP<0.01。

Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組Krox20及Oct6的蛋白表達水平降低(P<0.01)；與模型組比較，附子高劑量及低劑量組Krox20的蛋白表達水平升高(P<0.01)，附子不同劑量組Oct6蛋白水平表達均升高(P<0.01)。見圖3及表5。

表4 附子對Krox20及Oct6基因表達水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

注：A.正常組B.對照組C. 模型組D.附子高劑量組E.附子中劑組F.附子低劑量組

表5 附子對Krox20及Oct6蛋白表達水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

髓鞘是包圍在軸突的膜層結構，主要由施萬細胞組成。它可以保護軸突并促進受損的軸突再生。糖尿病可以引起髓鞘再生受損，進一步會發生糖尿病周圍神經病變。

生理狀態下，Krox20-Oct6信號通路是髓鞘形成的關鍵步驟，是施萬細胞髓鞘化的必要轉錄因子[9]。Oct6促進施萬細胞從前髓鞘化狀態向髓鞘化轉變，Oct6作為轉錄因子可以調控施萬細胞中髓鞘表型相關標記物如MBP、P0和MPZ的表達[10]。在Oct6敲除小鼠中，坐骨神經髓鞘化程度顯著受損，MBP、P0和MPZ水平降低[11]。Krox20促進髓鞘化的完成，在髓鞘形成的過程中持續表達，參與髓鞘蛋白MBP、P0和MPZ的轉錄。在Krox20敲除小鼠中，坐骨神經可見脫髓鞘現象，MBP、P0和MPZ水平降低[12]。Oct6和Krox20在髓鞘形成的過程中作用明顯不同[13]，但是又相互依賴，共同調節髓鞘的形成。

本研究發現高濃度葡萄糖可造成施萬細胞中Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表達下調，而附子則可以上調Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表達，且Oct6、Krox20、MBP、MPZ的基因表達水平與蛋白的表達趨勢一致。結合本課題組前期研究結果，可以推測葡萄糖濃度升高時，Krox20-Oct6信號通路被抑制，施萬細胞中髓鞘蛋白的合成減少，從而使髓鞘受到損傷，導致神經傳導障礙或溫度感覺異常。而附子則能通過Krox20-Oct6信號通路促進髓鞘組成成分基因及蛋白的表達，使髓鞘功能得以改善，從而使神經傳導與溫度感知功能得以恢復。

本研究不僅從髓鞘形成的角度探討了DPN的發病機制，為DPN的治療提供了潛在的藥物靶點，而且揭示了附子治療DPN的分子機制，為后期附子活性物質的研究奠定了基礎。

[1] Dyck PJ, Kratz KM, Karnes JL, et al.The prevalence by staged severity of various types of diabetic neuropathy, retinopathy, and nephropathy in a population-based cohort: the Rochester Diabetic Neuropathy Study[J].Neurology,1993,43:817-824.

[2] Sugimoto K, Murakawa Y, Sima AA.Diabetic neuropathy: a continuing enigma[J].Diabetes/metabolism Research and Reviews,2000,16(6):408-433.

[3] Vinik AI, Park TS,Stansberry KB, et al. Diabetic neuropathies Diabetolojia[J].Diabetoloqia,2000,43(8):957-973.

[4] 張明發.附子溫里藥理的研究[J].陜西中醫,1994,15(2):88-91.

[5] 史瑞鋒,初杰.從古代本草文獻看附子的應用[J].遼寧中醫雜志,2008,35(9):1344-1345.

[6] Han J, Tan P, Li Z, et al.Fuzi Attenuates Diabetic Neuropathy in Rats and Protects Schwann Cells from Apoptosis Induced by High Glucose[J].Plos One,2014,9(1):e86539.

[7] Glenn T D, Talbot W S. Signals regulatingmyelination in peripheral nerves and the Schwann cell response to injury[J].Current Opinion in Neurobiology,2013,23(6):1041-1048.

[8] Svaren J, Meijer D. The molecular machinery of myelin gene transcription in Schwann cells[J].Glia，2008,56(14):1541-1551.

[9] Kawasaki T, Oka N, Tachibana H, et al. Oct6, a transcription factor controlling myelination, is a marker for active nerve regeneration in peripheral neuropathies[J].Acta neuropathologica,2003,105(3):203-208.

[10] Verrier JD, Semple-Rowland S, Madorsky I, et al. Reduction of Dicer impairs Schwann cell differentiation and myelination[J].Neurosci Res,2010,88(12):2558-2568.

[11] Bermingham JR Jr, Scherer SS, O’Connell S, et al. Tst-1/Oct-6/SCIP regulates a unique step in peripheral myelination and is required for normal respiration[J].Genes Dev，1996,10(14):1751-1762.

[12] Topilko P, Schneider Maunoury S, Levi G, et al. Krox-20 controls myelination in the peripheral nervous system[J].Nature，1994,371(6500):796-799.

[13] Zorick T. S, Syroid D. E, Brown A, et al. Krox-20 controls SCIP expression, cell cycle exit and susceptibility to apoptosis in developing myelinating Schwann cells[J].Development (Cambridge, England)，1999,126(7):1397-1406.

(本文編輯： 禹佳)

Aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath and the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose

LVTiantian，WANGHongliang，XINGWei，etal.BasicMedicalCollegeofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

Correspondingauthor:HANJing,E-mail:hanjing8585@163.com

Objective To investigate the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose and to analyze the effect of aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath, and then clarify the mechanisms underlying the therapeutic effect of aconiti lateralis radix praeparata in diabetic peripheral neuropathy. Methods Schwann cell were divided into six groups. In the control group, the cells were supplemented with normal cell culture medium. In the mannitol group, the cells were fed with normal glucose plus mannitol. In the model group, the cells were supplemented with high glucose medium. In the other group, the cells were treated with high glucose medium plus different concentrations of aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL). After three days, Real-time PCR was used to detect the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero mRNA. Western blot was used to detect Oct6 and Krox20 protein expression. Myelin basic protein and myelin protein zero protein expression was detected by immunofluorescence. Results PCR results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. Western blot results indicated that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6 and Krox20. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata(0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6 and Krox20. Immunofluorescence results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. Conclusion These results indicates that high glucose can decrease the protein of myelin sheath by inhibiting Krox20-Oct6 pathway and that aconiti lateralis radix praeparata improves the diabetic peripheral neuropathy via enhancing the formation of myelin sheath.

Diabetic peripheral neuropathy(DPN); Aconiti lateralis radix praeparata; Schwann cells; Krox20-Oct6 signaling pathway

國家自然科學基金(30901959)；北京中醫藥大學自主課題(0100604165)

100029 北京中醫藥大學基礎醫學院[呂甜甜(碩士研究生)、王宏亮、邢瑋、吳晏、王偉、張子劍、韓靜]

呂甜甜(1989- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：糖尿病周圍神經及視網膜并發癥。E-mail：lvtiantian471398@163.com

韓靜(1977- )，女，博士，副研究員。研究方向：糖尿病周圍神經及視網膜并發癥。E-mail：hanjing8585@163.com

R932

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.003

2016-03-21)