PDGFRA在肺癌細胞系中的表達及其對細胞增殖和侵襲能力的影響

陸 玲， 黃志衛

(1.廣西壯族自治區北海市結核病防治院呼吸內科， 廣西 北海 536000 2.廣西壯族自治區欽州市第一人民醫院重癥醫學科， 廣西 欽州 535000)

PDGFRA在肺癌細胞系中的表達及其對細胞增殖和侵襲能力的影響

陸 玲1， 黃志衛2

(1.廣西壯族自治區北海市結核病防治院呼吸內科， 廣西 北海 536000 2.廣西壯族自治區欽州市第一人民醫院重癥醫學科， 廣西 欽州 535000)

目的：明確血小板源性生長因子受體A(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)對肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法：在8種肺癌細胞系以及正常肺細胞HBE中通過RT-PCR方法檢測PDGFRA的基本表達水平，分別選取PDGFRA表達高的兩組肺癌細胞系(A549)通過慢病毒轉染構建穩定knock down和過表達PDGFRA細胞系，再進一步通過MTS，劃痕實驗，transwell實驗以及western-blot實驗明確PDGFRA對肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。 結果：與對照組相比，過表達PDGFRA后，細胞增殖以及侵襲能力顯著增加，同時與侵襲能力相關的細胞黏附分子E-cadherin和細胞骨架蛋白Vimentin表達上調，劃痕實驗和transwell實驗結果表明PDGFRA能夠促進細胞侵襲能力。在knock down PDGFRA細胞系中，細胞增值能力降低，細胞黏附分子E-cadherin和細胞骨架蛋白Vimentin表達下調，與對照組相比，細胞侵襲能力下降。結論：PDGFRA能夠促進肺癌細胞增殖并有助于肺癌細胞的侵襲轉移。

血小板源性生長因子受體α； 細胞增殖； 細胞侵襲； 肺癌細胞

在各類惡性腫瘤中，肺癌是的發病率和死亡率居于第一[1]。肺癌患者的預后較差，其發生機制尚不明確。血小板源性生長因子受體α多肽(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)是一種生長因子受體，是胃腸道間質瘤的重要參考指標[2]。研究表明，PDGFRA可表達于多種腫瘤細胞，且與惡性腫瘤的發生發展密切相關，在多種腫瘤中都可檢測到PDGFRA基因發生突變，其中包括肺癌[3,4]。在腫瘤的發生發展過程中，生長因子通過與特異性受體結合，進而影響腫瘤細胞的增殖及侵襲能力。本研究擬探討PDGFRA對肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞:人正常肺支氣管上皮細胞HBE，人肺癌細胞系A549、H358、PC9、95C、H1299均購自中國醫學科學院研究中心。

1.2 主要試劑:RPMI-1640培養基(Hyclone)、DMEM培養基(Hyclone)、Fetal Bovine Serum (Hyclone)、逆轉錄試劑盒(Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、細胞增殖能力檢測試劑盒(MTS, Promega)、BCA Assay Reagent(美國Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)。

1.3 主要抗體:PDGFRA antibody (santa cruz, sc-338)、E-cadherin antibody(Abcam, ab15148)、Vimentin antibody(Abcam, ab92547)、β-actin antibody(santa cruz, sc-4778)。

1.4 RT-PCR檢測PDGFRA基因的表達:TRIZOL法抽提細胞總RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度，取5μg RNA進行逆轉錄反應，采用Cyber Green熒光實時定量PCR反應體系檢測基因表達水平。反應條件：預變性 94℃4 min，擴增條件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個循環。PDGFRA 上游引物: TTGAAGGCAGGCACATTTACA; PDGFRA下游引物：GCGACAAGGTATAATGGCAGAAT；擴增引物大小為119bp。以β-actin為內參基因，其上游引物序列為TGGCACCCAGCACAATGAA；下游引物序列為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；目的片段大小為186bp。

1.5 Western-Blot檢測PDGFRA、E-cadeherin以及Vimentin表達水平 收集肺癌細胞，裂解液裂解，提取蛋白質，BCA 法行蛋白定量分析，濕轉至 PVDF 膜，5 % 脫脂奶粉封閉 1.0h，一抗 4℃孵育過夜，二抗 37℃孵育 1.5h，發光液曝光顯影。一抗濃度比為1：1000，二抗濃度比為1：3000，以β-actin作為內參。

1.6 慢病毒轉染構建穩定knock down PDGFRA細胞系 利用二代慢病毒包裝系統在A549細胞中構建穩定knock down PDGFRA 細胞系，用Lipofectamine 2000以2.5:1的體積比將慢病毒shRNA質粒(6μg/dish)、packing質粒(psPAχ2, 4.5μg/ dish)和envelop質粒(pMD2.G; 1.5 μg/ dish)一并轉入293T細胞,7h后更換正常培基，培養48h，過濾收集上清液，并將帶有慢病毒的上清液感染A549細胞，感染3d后，使用puromycin篩選穩定細胞系，并進行Western-Blot驗證。有效shRNA序列為 shPDGFRA#1: GCCTTTGTACCTCTAGGAATG; shPDGFRA#2：GCTTGAAGGCAGGCACATTTA; shCtrl: CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA,具體步驟參見文[5]。

1.7 MTS法檢測細胞增殖活力:收集對數生長期細胞，以4×103個細胞每孔的細胞濃度，將細胞接種至96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液(設置5個復孔)，置于5%CO2，37℃培養箱中培養。分別檢測細胞24h，48h以及72h的細胞增殖活力，MTS與培基以1:5的比例混合均勻，混勻后于生化培養箱中孵育60min后用多孔板酶標儀在490nm檢測吸光度。

1.8 細胞侵襲實驗以及細胞劃痕修復實驗:采用 Transwell 小孔遷移試驗檢測細胞的侵襲能力，具體步驟見參見文[6]及說明書。

2 結 果

2.1 五株人肺癌細胞系中PDGFRA的基本表達水平:運用 RT-PCR 方法檢測發現，肺癌細胞中PDGFRA的 mRNA 水平相較人正常肺支氣管上皮細胞(HBE)均顯著升高，其中 A549 肺癌細胞的PDGFRA水平最高(圖 1)。進一步用 Western-blot方法檢測PDGFRA的蛋白水平(圖 2)，同樣也發現在五株肺癌細胞系中PDGFRA的蛋白水平也均高于正常肺上皮細胞，而且蛋白水平與 mRNA 相一致。

圖1 PDGFRA在正常肺上皮細胞及五種肺癌細胞系中的mRNA表達水平

圖2 PDGFRA在正常肺上皮細胞及五種肺癌細胞系中的蛋白表達水平

2.2 在A549細胞中構建穩定knock down PDGFRA細胞系，檢測其mRNA和蛋白水平以及對細胞增殖活力的影響:針對PDGFRA基因，設計兩組shRNA以及對照組隨機插入序列，利用二代包裝系統包裝成慢病毒。挑選PDGFRA表達最高的A549使用慢病毒進行感染，觀察干擾效果。慢病毒連續感染二次后，使用puromycin進行篩選，獲得穩定knock down PDGFRA細胞系。收集細胞抽提總蛋白以及RNA，利用Western-blot及RT-PCR方法檢測PDGFRA的mRNA及蛋白表達水平。進而利用MTS方法檢測knock down PDGFRA后，細胞增殖活力的變化。實驗結果如圖3～5所示，兩組shRNA慢病毒干擾序列均有效，其中#1干擾效率為50%，#2干擾效率為70%以上，RT-PCR檢測PDGFRA在A549細胞中的表達水平，結果如圖3所示，表明干擾效果均有顯著抑制，并具有統計學意義。進一步抽提細胞總蛋白，Western-Blot分析慢病毒感染后對蛋白水平PDGFRA的下調水平，發現shPDGFRA#1和shPDGFRA#2慢病毒感染后，PDGFRA蛋白表達水平均顯著下調，尤其是shPDGFRA#2的A549細胞中，下調最為明顯，結果與mRNA檢測一致，如圖4所示。MTS法連續檢測3d對照組及knock down PDGFRA穩定細胞系中的細胞增殖活力改變，如圖5所示，在經過慢病毒感染后的穩定knock down PDGFRA細胞中，細胞在第2天細胞增殖活力下調，在第3天細胞增殖活力顯著下調，且都具有統計學差異，這表明PDGFRA基因能夠促進肺癌細胞的增殖能力。

圖3 慢病毒感染A549細胞對PDGFRA的mRNA表達水平的影響

圖4 慢病毒感染A549細胞對PDGFRA的蛋白水平的影響

圖5 干擾下調PDGFRA表達對肺癌細胞增殖活力的影響

2.3 干擾PDGFRA表達水平對肺癌細胞侵襲能力的影響:因shPDGFRA#2細胞對PDGFRA的干擾最為明顯，故本實驗選定shPDGFRA#2穩定敲除PDGFRA的A549細胞進行侵襲實驗，采用 Matrigel 侵襲實驗檢測PDGFRA穩定敲除細胞及對照組細胞中，細胞侵襲能力的變化。如圖6所示，對照組A549細胞穿過人工基底膜的細胞數為864.0±46.9個，而在慢病毒感染下調PDGFRA的實驗組中，細胞數為156.0±35.8，與對照組相比，穩定敲除PDGFRA的肺癌細胞穿過人工基底膜的細胞數顯著下調(P<0.001)，結果提示PDGFRA可能在肺癌的侵襲過程發揮促侵襲作用。

圖6 感染下調PDGFRA表達水平對肺癌細胞侵襲能力的影響

2.4 干擾下調PDGFRA表達水平對肺癌細胞轉移能力的影響:通過細胞劃痕修復實驗，觀察對照組細胞以及穩定敲除PDGFRA的shPDGFRA#2細胞系中，肺癌細胞遷移能力的改變。在劃痕剛開始及24h后這兩個時間點進行拍照，比較兩組細胞的遷移能力，如圖7所示，與對照組相比，下調PDGFRA后細胞遷移能力下調，這表明PDGFRA可能在肺癌細胞的轉移過程中發揮促進作用。

圖7 干擾下調PDGFRA表達水平對肺癌細胞轉移能力的影響

2.6 干擾下調PDGFRA表達水平對肺癌細胞中E-cadeherin和Vimentin蛋白表達水平的影響:有文獻報道指出E-cadeherin和Vimentin在上皮間充質轉化中發揮重要作用，它們的表達水平可作為腫瘤細胞侵襲轉移的標志性特征。而上述研究表明PDGFRA可能在肺癌細胞侵襲轉移過程中發揮促進作用。因此，筆者抽提慢病毒感染后構建的A549穩定敲除PDGFRA細胞系的總蛋白，Western-Blot檢測E-cadeherin和Vimentin的蛋白表達水平。如圖8所示，PDGFRA下調后，E-cadeherin和Vimentin的表達水平都有顯著下調，這進一步證實了，PDGFRA在肺癌細胞侵襲轉移過程中的重要作用。

圖8 干擾下調PDGFRA表達水平對肺癌細胞E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的影響

3 討 論

血小板源性生長因子受體A((platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)PDGFRA 位于染色體4q12，與配體PDGFS結合后，可促進腫瘤的血管生成。有研究報道，在肺鱗癌中，PDGFRA有8.7%的高表達[7]。在針對PDGFRA表達的各種腫瘤研究中，對比腫瘤細胞和正常上皮細胞，出現了幾乎一致的結果，表明PDGFRA與腫瘤的惡性化程度密切相關，并且PDGFRA 的突變異構體近年來在腫瘤的研究中越來越熱門，在肺癌及胃腸道腫瘤中，PDGFRA具有較高的突變率。PDGFRA的突變會致使KIT酪氨酸激酶持續活化，細胞增殖分化失控[8]。楊柳青等研究發現胃腸道間質瘤患者的預后復發性轉移與PDGFRA的突變呈正相關。顧健人等研究發現在非小細胞肺癌中，PDGFRA的突變為3.1%且與患者的預后不良及非細胞肺癌的侵襲轉移有關。這些研究都表明PDGFRA在腫瘤的發生發展過程中作為促癌基因起作用，而在肺癌相關的PDGFRA研究中，發現PDGFRA在腫瘤發生侵襲轉移前的持續性活化對于腫瘤的侵襲轉移可能具有促進作用，其機制目前尚未明確。

本研究運用 RT-PCR、Westernblot 及慢病毒構建穩定knock down細胞系等方法檢測細胞中 PDGFRA的表達， 研 究 結 果 發 現 肺 癌 細 胞 中 PDGFRA的mRNA 和蛋白表達水平高于正常的人肺上皮細胞，進一步通過慢病毒轉染構建穩定敲除PDGFRA的A549細胞系，發現PDGFRA下調后，腫瘤細胞增殖活力降低，這表明PDGFRA能夠促進腫瘤細胞的增殖。針對 PDGFRA促細胞增殖的能力，結合臨床研究中PDGFRA的突變對患者預后及復發性侵襲轉移的促進作用，在體外水平監測了下調PDGFRA后，細胞侵襲和轉移能力明顯下調，結果與郝騰等報道的PDGFRA相關肺癌臨床研究相互佐證，確認了PDGFRA對肺癌細胞侵襲能力的促進作用。

目前對于PDGFRA在腫瘤中高表達以及其對腫瘤的侵襲能力作用機制尚未明確，本研究發現，在肺癌細胞系中PDGFRA高水平表達，同時干擾PDGFRA的表達可以有效的降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力，在分子水平，PDGFRA下調后，能夠顯著下調E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的表達。E-cadeherin是一種細胞黏附分子，在所有上皮組織中都表達，能夠介導上皮細胞的黏附，而細胞間黏附能力的改變是腫瘤發生轉移的前提條件，在我們的研究中發現，PDGFRA能夠直接影響E-cadeherin的表達，提示在腫瘤發生侵襲轉移的過程中，PDGFRA可能通過介導間充質上皮轉換的相關分子表達，進而有助于腫瘤細胞的侵襲轉移。Vimentin是一種波形蛋白，與腫瘤細胞的運動能力密切相關，同時也是癌細胞發生間充質轉換的下游標志信號分子，下調PDGFRA后，Vimentin的表達也同時被抑制。

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Effect of PDGFRA on Cell Proliferation and Invasion in Lung Cancer Cell Lines

LULing,etal

(.DepartmentofRespiratoryMedicineofBeihaiTuberculosisPreventionandTreatmentInstitute,GuangxiBeihai536000,China)

Objective: To evaluate the effect of platelet derived growth factor receptor alpha(PDGFRA) on the proliferation and invasion of lung cancer cells. Methods: The mRNA expression level of PDGFRA in eight lung cancer cell lines and normal lung cell HBE was detected by PT-PCR. Two groups of lung cancer lines(A549) from the high expression level of PDGFRA were selected, then stable knock down and over-expression PDGFRA cell lines were constructed through lentiviral transfection. Furthermore, the effect of PDGFRA on cell proliferation and invasion in these cells were evaluated by MTS, scratch test, Transwell and western-blot test. Results: Over-expression of PDGFRA showed that cell proliferation and invasion significantly increased, meanwhile, E-candherin and Vimentin also increased, scratch test and transwell revealed that PDGFRA significantly improved the cell invasion. Whereas, knock down of PDGFRA decreased the cell proliferation, the expression of E-candherin and Vimentin decreased and the cell invasion also significantly also decreased compared with the control group. Conclusion: PDGFRA can promote the cell proliferation and contribute to the cell invasion in lung cancer cells.

PDGFRA; Cell proliferation; Cell invasion; Lung cancer cells

廣西壯族自治區醫藥衛生計劃項目,(編號：Z2014323)

1006-6233(2017)02-0259-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.025