與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty—3緊密連鎖標記的比較與分析

王輝++董盼盼+李文麗++王富

摘要：以番茄黃化曲葉病毒?。╰omato yellow leaf curf virus，簡稱TYLCD）抗病純合基因型（Ty-3/Ty-3）材料A45、感病純合基因型（ty-3/ty-3）材料A39及其構建的F2代分離群體（145個單株）為試驗材料，采用接種鑒定的方法，同時進行TYLCV抗性遺傳分析，比較P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19等3個標記與Ty-3基因的連鎖程度。結果顯示，番茄黃化曲葉病毒病抗性遺傳符合1對顯性基因控制；P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19等3個標記與抗病基因Ty-3間的遺傳距離分別為15.2、14.5、10.3 cM；利用分子標記UF_TY3-P19可提高黃化曲葉病毒病抗性材料的效率。

關鍵詞：番茄；黃化曲葉病毒??；Ty-3基因；分子標記

中圖分類號： S436.412.1+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0071-03

收稿日期：2015-10-12

基金項目：山東省良種工程農業生物資源創新利用研究項目（編號：PTBR2013）；青島市民生計劃（編號：13-1-3-3-nsh）；山東省現代農業產業技術體系（編號：SDAIT-02-022-02）；山東省自然科學基金（編號：ZR2010CM047、ZR2014CQ034）；青島農業大學高層次人才科研基金（編號：663-1115041）。

作者簡介：王輝（1981—），男，山東鄆城人，博士，主要從事蔬菜遺傳育種及生物技術研究。E-mail：fromstick@163.com。

通信作者：王富，博士，教授，研究方向為番茄遺傳育種及生物技術。E-mail：wangfuabcd@163.com。

番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）是侵染番茄的重要病毒之一，近年來因其在番茄上的廣泛流行而受到人們的關注。傳統的番茄抗TYLCV育種受到時間、環境等的限制，缺乏快速的檢測鑒定方法。近年來，分子標記技術輔助育種被廣泛應用，相對于傳統育種，分子標記輔助育種可以縮短育種周期，并且可以從分子水平找到相關抗性基因和相關位點。因此，研究挖掘利用有效的分子標記，對相關育種工作具有重要意義。

番茄抗TYLCV植株材料先后在細葉番茄（Solanum pimpinellifolium）、秘魯番茄（Solanum peruvianum）、智利番茄（Solanum chilense）、多毛番茄（Solanum habrochaite）、契斯曼尼番茄（Solanum cheesmaniae）等野生材料中發現?？乖床牧喜煌?，其抗性遺傳規律也不同。目前已發現的抗性基因主要有 Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、Ty-5[1-7]。Ty-3抗性基因最早的報道是在2007年，Ji等通過易感番茄品種7781x抗病自交系021108（Lycopersicon chilense LA2779）、易感番茄品種8248X抗病自交系034611（Lycopersicon chilense LA1932）雜交獲得的F2代分離群體進行連鎖分析及QTL定位分析[4]，確定Ty-3抗性基因位點位于番茄6號染色體長臂的Cleg-31-P16 （20cM）、T1079 （27cM）之間。隨著研究工作的開展，Ty-3基因位點被進一步精確定位，Ty-3基因被定為在標記UF_TY3-P1、UF_TY3-P23之間，約71 kb間隔內[8-9]。在最新研究中，Ty-1、Ty-3是等位基因并且同時編碼1個未知功能的依賴RNA的RNA聚合酶。

本研究中，利用抗病品種A45（Ty-3/Ty-3）、感病品種A39（ty-3/ty-3）分別作為父、母本，獲得F1、F2代，通過接種鑒定的方法研究抗性基因Ty-3的遺傳規律，并通過2種較為成熟的分子標記方法，即穩定性較高的序列特異性擴增區（sequence characterized amplified regions，簡稱SCAR）標記技術和多態性較好的酶切擴增多態性序列（cleaved amplified polymorphism sequences，簡稱CAPS）標記技術，對該抗性基因進行分子標記檢測，確定穩定性好、多態性高、不易受環境影響的分子標記，以期為抗番茄黃化曲葉病毒病育種工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

番茄抗病純合基因型（Ty-3/Ty-3）材料A45（P1）、感病純合基因型（ty-3/ty-3）材料A39（P2）來源于青島農業大學園藝學院，雜交后獲得F1代，F1代自交獲得F2代群體。PCR酶切試驗所用試劑（限制性內切酶AluⅠ、內切酶Buffer等）購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2試驗方法

1.2.1番茄TYLCV接種鑒定番茄材料播種育苗后，采用農桿菌接種法對番茄葉片進行TYLCV接種，接種所需的番茄黃化曲葉病毒農桿菌菌株（GV3101 pCAMBIA0390_TY-19mer）由韓國釜山大學Young-su Seo教授惠贈。根據Lapidot等的病情分級標準[10-11]發展而來的番茄黃化曲葉病毒病癥鑒定標準對番茄黃化曲葉病毒病癥狀進行鑒定，病情2級以上為感病。

1.2.2分子標記對番茄TYLCV的抗性檢測使用CTAB法提取采集的番茄葉片基因組DNA，檢測質量后將濃度稀釋到20 ng/μL，用于PCR檢測。根據國內外相關報道[7，9]，選取與抗病基因Ty-3緊密相連且表達穩定的分子標記（SCAR標記P6-25、UF_TY3-P19，CAPS標記UF_TY3-P23），用于檢測番茄群體材料抗性，詳見表1。

PCR反應體系：100 ng DNA，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L的dNTPs，各1.0 μL 10 μmol/L上下游引物，0.3 μL Taq聚合酶 （TaKaRa），用ddH2O補足至25 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。酶切反應體系：5 μL PCR擴增產物，1.5 μL CutSmart buffer，0.2 μL內切酶 （TaKaRa），用ddH2O補足至15 μL。酶切在PCR儀或者水浴鍋中進行，于37 ℃酶切1 h。取約10 μL PCR擴增產物，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR擴增結果，用Bio-RAD自動凝膠成像系統觀察照相，記錄電泳結果。

2結果與分析

2.1番茄群體抗TYLCV表現型分析

在接種18 d后對P1（5株）、P2（5株）、F1（10株）、F2（145株）進行病情發病情況調查，初步觀察后發現，TY抗病植株不表現病狀，感病植株表現出上部新葉黃化、葉片邊緣開始卷曲、葉片變小等癥狀。對群體植株調查后結果顯示，P2植株全部表現為感病，P1、F1植株表現為抗病，F2抗病植株、感病植株比為102 ∶[KG-*3]43（2.37 ∶[KG-*3]1）；通過卡方檢驗可知，F2群體的χ2=1.811，P值=0.178 4，表明該性狀符合3 ∶[KG-*3]1的分離比例（表2）。根據孟德爾遺傳規律推測，該遺傳群體對于TYLCV的抗性是由顯性單基因控制的。

2.2番茄群體抗TYLCV基因型分析

利用與Ty-3基因緊密連鎖的分子標記P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19對F2代群體的單株DNA進行PCR擴增，檢測其Ty-3抗性。對PCR擴增產物電泳檢測后發現，SCAR標記P6-25、UF_TY3-P19在PCR后可以清晰地區分Ty-3純合抗病、雜合抗病、抗病，且P6-25在F2代群體的基因型比為20 ∶[KG-*3]95 ∶[KG-*3]30，UF_TY3-P19在F2代群體的基因型比為24 ∶[KG-*3]84 ∶[KG-*3]37（圖1、圖2）；對CAPS標記 UF_TY3-P23 的PCR產物經AluⅠ酶切后發現，PCR產物在純合抗性材料中，無法酶切，只有1個特異性片段，感病材料被酶切成2個特異性片段，UF_TY3-P23在F2代群體的基因型比為 30 ∶[KG-*3]84 ∶[KG-*3]31（圖3）。

2.3番茄群體抗TYLCV基因型與表型對比分析

[CM（24]145株F2代植株通過與Ty-3緊密連鎖的分子標記進[CM）]

[FK（W8][TPWH3.tif]

行抗性檢測，如果將分子標記檢測的雜合抗性材料視為抗病植株，綜合接種鑒定后結果對比分析表明，3個分子標記與Ty-3存在一定的遺傳距離（表3）。通過對F2代群體的遺傳分析發現，標記P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19與番茄抗黃化曲葉病基因的Ty-3間的連鎖距離分別是15.2、145、10.1 cM；標記UF_TY3-P23、UF_TY3-P19比P6-25更靠近Ty-3，因此可以推測，在檢測番茄Ty-3抗性結果[JP3]時，標記UF_TY3-P19比UF_TY3-P23、P6-25更具有準確性。

3小結與討論

番茄TYLCV抗性育種，離不開抗病性鑒定。本試驗的TYLCV抗病性鑒定采用農桿菌注射法，在番茄苗期進行簡單快速的鑒定。與嫁接法、煙粉虱傳毒等方法相比，本方法簡單易行，不受季節、煙粉虱密度、植株材料等因素的影響[12]，但是保證該方法順利進行的前提是準備TYLCV克隆的農桿菌菌種，而對TYLCV進行克隆轉化需要大量的時間。另外，對含有TYLCV的農桿菌接種時，除了本試驗中采取壓力法通過不帶針頭的注射器將接種液壓入番茄葉片背面，還可以利用帶針頭的注射器在番茄植株近根處的韌皮部部位進行注射接種[13]，但是直接注射的接種液量少，不如壓力法接種充分。

在對接種TYLCV植株進行病情鑒定時，通過植株的癥狀

表現來確定是否染毒，不表現TYLCV癥狀的植株是抗性植株。由于目測癥狀具有一定的不確定性。因此，在本試驗中檢測的分子標記與抗性基因的遺傳距離，與前人研究有一定差異。其主要原因為本試驗將Ty-3基因進一步定位，進一步完善了Ji等的研究[7-9]；另外，本研究只對145株F2代群體進行研究，樣品數量不夠大，接種后番茄植株是采取生物學鑒定的方法進行病情調查的，此方法簡單快捷，但是容易受到個人主觀感覺的干擾，也有可能影響接種鑒定結果。

本研究使用的標記（P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19）與Ty-3基因均存在一定的遺傳距離，但與P6-25相比，UF_TY3-P23、UF_TY3-P19這2個標記與Ty-3間存在更緊密的連鎖關系，因此這2個標記，尤其是UF_TY3-P19用于篩選抗TYLCV的番茄種質資源效率更高。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1][ZK（#]Zamir D，Ekstein-Michelson I，Zakay Y，et al. Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene，TY-1[J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，88（2）：141-146.

[2]Yang X H，Caro M，Hutton S F，et al. Fine mapping of the tomato yellow leaf curl virus resistance gene Ty-2，on chromosome 11 of tomato[J]. Molecular Breeding，2014，34（2）：749-760.

[3]Ji Y F，Scott J W，Schuster D J. Toward fine mapping of the tomato yellow leaf curl virus resistance gene Ty-2 on chromosome 11 of tomato[J]. HortScience，2009，44（3）：614-618.

[4]Ji Y F，Schuster D J，Scott J W. Ty-3，a begomovirus resistance locus near the Tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty-1 on chromosome 6 of tomato[J]. Molecular Breeding，2007，20（3）：271-284.

[5]Ji Y F，Scott J W，Schuster D J，et al. Molecular mapping of Ty-4，a new tomato yellow leaf curl virus resistance locus on chromosome 3 of tomato[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2009，134（2）：281-288.

[6]Liana A，Reuveni M，Azari R. Molecular dissection of tomato lear curl virus resistance in tomato line TYl72 derived from Solasum peruvianum[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119：519-530.

[7]Ji Y，Betteray B V，Smeets J，et al. Co-dominant SCAR Marker，P6-25，for detection of Ty-3，Ty-3a，and Ty-3b introgressions from three solanum chilense accessions at 25 cM of chromosome6 of begomovirus-resistant tomatoes[J/OL].[2015-10-10].http：//www.plantpath.wisc.edu/geminivirus resistant tomatoes/markers/MAS-protocols/P6-25-locus.Pdf.

[8]Verlaan M G，Szinay D，Hutton S F，et al. Chromosomal rearrangements between tomato and Solaum chilense hamper mapping and breeding of the TYLCV resistance gene Ty-1[J].The Plant Journl，2011，68：1093-1103.

[9]Verlaan M G，Hutton S F，Ibrahem R M，et al. The tomato yellow leaf curl virus resistance genes Ty-1 and Ty-3 are allelic and code for DFDGD-class RNA-dependent RNA polymerases[J]. PLoS Genetics，2013，9（3）：178-179.

[10][ZK（#]Lapidot M，Weil G，Cohen L，et al. Biolistic inoculation of plants with tomato yellow leaf curl virus DNA[J]. Journal of Virological Methods，2007，144（1/2）：143-148.

[11]Lapidot M，Ben-Joseph R，Cohen L，et al. Development of a scale for evaluation of tomato yellow leaf curl virus resistance level in tomato plants[J]. Phytopathology，2006，96（12）：1404-1408.

[12]Picó B，Ferriol M，Díez M J，et al. Agroinoculation methods to screen wild Lycopersicon for resistance to tomato yellow leaf curl virus[J]. Journal of Plant Pathology，2001，83（3）：215-220.

[13]楊瑪麗，彭宏，陳天子，等. RNAi介導的轉基因番茄抗TYLCV研究[J]. 西南農業學報，2014，27（6）：2511-2516.