花生金屬蛋白酶家族基因FtsH的鑒定、分類和鹽脅迫表達分析

鄭春花++孔祥遠++隋炯明++束晨++趙春梅

摘要：FtsH是一種ATP和Zn2+依賴型金屬蛋白酶，在植物抗逆脅迫中發揮了重要作用。為分析花生中FtsH家族成員情況，構建花生葉片轉錄組數據文庫，篩選出19個FtsH家族基因，位于花生A組野生種的8條染色體上，與擬南芥、水稻的FtsH基因進行同源序列比對后發現，多數FtsH基因沒有聚到已報道的亞類。利用花生耐鹽突變體（S2）和對照（S4）構建鹽脅迫處理前后各時間段的表達譜文庫，進行FtsH基因鹽脅迫表達分析，結果表明，9個FtsH基因受鹽脅迫誘導表達，絕大多數FtsH基因在耐鹽突變體和對照中表現出不同的表達模式。該研究為花生金屬蛋白酶基因的功能研究與耐鹽分子育種提供了基礎。

關鍵詞：花生；FtsH基因；基因表達譜；耐鹽突變體；鹽脅迫

中圖分類號： S565.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0074-03

收稿日期：2016-08-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：31571705、31301356、31471542）；山東省科技發展計劃（編號：2014GNC110002）。

作者簡介：鄭春花（1979—），女，山西忻州人，碩士，圖書館員，主要從事生物信息學分析。E-mail：zchsjm@163.com。

通信作者：趙春梅，博士，副教授，主要從事作物分子育種研究。E-mail：meiwei2002@163.com。

FtsH屬于AAA蛋白酶家族，是一種ATP和Zn2+依賴型蛋白，在生物體內廣泛分布[1]。FtsH負責細菌原生質膜、線粒體膜、葉綠體膜上未裝配蛋白的降解，通過降解非復合體形式的自由亞基，可以避免有害物質的大量積累[2-3]。在高等植物中，FtsH蛋白參與D1蛋白光氧化損傷產物的降解，現己證實FtsH具有降解快速周轉的蛋白的功能，FtsH是植物抵抗光抑制過程中PSⅡ復合物修復的關鍵成分之一[4]。FtsH蛋白除了作為蛋白酶發揮功能外，還作為分子伴侶參與蛋白的裝配和折疊[5-7]。

已有研究表明，擬南芥的12個FtsH基因和水稻的FtsH基因可以分為8個亞族，每個亞族的成員蛋白序列高度保守，種內同源物相似性大于80%，且種間同源物的相似性也大于70%[8]。FtsH不僅參與生物體內正常的代謝調節過程，而且與多種逆境脅迫響應密切相關，有些成員在植物抵抗熱激和高滲、鹽害、冷脅迫和病原菌等脅迫中發揮著重要作用[9-11]。

筆者前期以花生胚小葉為外植體，通過平陽霉素離體誘變和羥脯氨酸定向篩選，獲得了一批羥脯氨酸耐性苗及其后代[12]，其中1個突變體（S2）在0.7%鹽溶液中發芽率超過50%，且具有較高的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性，而對照花育20（S4）在相同濃度的鹽溶液中發芽率只有6.7%。

為從整個轉錄組水平了解花生FtsH家族基因的情況，筆者用上述材料構建花生葉片轉錄組文庫，利用生物信息學研究手段，鑒定花生FtsH家族基因，進行FtsH基因的染色體定位和分類。然后構建耐鹽突變體S2和對照S4在鹽脅迫處理前后的表達譜，分析FtsH家族各成員在鹽脅迫處理前后表達量的變化，為全面了解FtsH家族成員在花生中的功能以及耐鹽分子育種奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用材料為平陽霉素離體誘變和羥脯氨酸定向篩選后穩定遺傳的耐鹽突變體（S2）和對照花育20（S4）。

1.2轉錄組數據庫構建

用250 mmol/L NaCl處理耐鹽突變體S2和對照S4，在0、6、12、24、48 h取葉片，每個樣品包含2個生物學重復?；旌虾髽嫿ㄞD錄組文庫，送交北京諾和致源公司進行雙向測序，組裝處理后獲得非冗余Unigene序列，在NCBIA數據庫注冊（注冊號SRR3114511）。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數據庫進行基因功能注釋。

1.3鹽脅迫處理前后表達譜數據庫構建

由北京諾和致源公司對鹽脅迫處理前后20個樣品進行數字化表達譜測序，構建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達譜數據庫（NCBI注冊號SRR3210665、SRR3210666）。

1.4基因家族成員鑒定、基因結構分析和染色體定位

根據NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數據庫的基因功能預測，搜索FtsH基因。利用生物信息學軟件分析蛋白結構域、分子量、理論等電點和可能的亞細胞定位。從花生全基因組數據（http：//www.peanutbase.org）下載A組野生種基因組序列，進行基因序列比對，取相似度最高的序列作為目標基因，并根據數據庫的預測結果和比對結果進行基因結構分析。根據與數據庫比對后的結果，標示基因在染色體上的位置，得到各個基因在染色體上的分布情況。

1.5系統進化樹的構建

通過Clustal X軟件對擬南芥、水稻FtsH蛋白進行序列比對分析，采用鄰接法生成FtsH基因的系統進化樹。

1.6鹽脅迫響應分析

將S2或S4樣品中，某一基因在脅迫處理前后0、6、12、24、48 h的任何2個時間段間的表達量進行比較，如果調整后的P<0.05，則認為該基因對鹽脅迫有響應。

2結果與分析

2.1花生FtsH家族基因的鑒定及它們在染色體上的分布

根據上述7大數據庫的基因功能預測結果，筆者從花生葉片轉錄組數據庫中篩選出25個候選FtsH基因。將其與公布的花生A組野生種基因組序列進行比對，其中6個基因（編號分別為c40440_g2、c35114_g1、c38335_g1、c44670_g2、c41532_g1和c19813_g1）因與其他基因比對到同一位置被剔除，最終得到19個花生FtsH基因。根據與花生A組野生種基因組的比對結果，確定了18個FtsH基因在A染色體組的分布情況，這些基因分布在8條染色體上，其中第2、8號染色體上不含有FtsH基因，第3、4、9、10號染色體分布的成員數量最多，有3～5個，其他各染色體含有1～2個FTSH基因，[JP2]c53069_g1在A染色體組沒有比對到相應序列（表1）?；ㄉ鶩tsH蛋白最長有 1 283 個氨基酸殘基，最短的有209個氨基酸殘基，其等電點范圍為4.91～10.09，除c53069_g1無法進行亞細胞定位外，其余18個蛋白中10個定位于葉綠體，8個定位于線粒體?；蚪Y構分析顯示，外顯子數為1～19個（表1）。

2.2花生FtsH基因的聚類分類

模式植物擬南芥、水稻分別有12、9個FtsH基因，可分為8個亞家族[8]。根據FtsH蛋白家族成員長度差異、含不同特征的結構域等特點，將花生19個FtsH蛋白與擬南芥和水稻基因組中全部FtsH蛋白進行多重序列比對和系統進化分析。聚類結果顯示，4、5、7亞家族只有擬南芥和水稻的FtsH基因，暫時沒有找到花生的FtsH基因；1、2、3、6、8亞家族分別包含1、2、1、1、1個FtsH基因，其他13個FtsH基因沒有聚到這8個亞家族，它們可能屬于一些新的亞族（圖1）。

[FK（W27][TPZCH1.tif]

2.3花生FtsH家族基因的鹽脅迫響應分析

筆者利用鹽脅迫處理前后S2、S4的20個數字表達文庫譜，在脅迫處理前后對19個FtsH基因的任意2個時間段的表達量進行比較，根據調整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導表達，結果見表2和圖2?？梢钥闯?，在S2中，與脅迫處理前相比，脅迫處理6、12 h后，差異表達的基因各有3個；脅迫處理48 h與12 h相比，也有3個差異表達的基因。而在S4中，脅迫處理48 h與12 h相比，差異表達的基因數最多，有5個上調，1個下調。

進一步分析發現，5個基因（c25618_g1、c40440_g1、c53069_g1、c37927_g1、c40421_g1）在S2和S4中均受脅迫誘導表達；2個基因（c32457_g1、c36613_g1）只在S2中受脅迫誘導表達；2個基因（c44096_g1、c31995_g1）只在S4中受脅迫誘導表達（表2、圖2）。S2中，c53069_g1和c44096_g1表達模式相同，均為上調—下調—上調—上調，c32457_g1和c36613_g1表達模式相同，均為上調—上調—下調—下調；S4中，c25618_g1和c40440_g1表達模式相同，均為下調—下調—上調—上調，c44096_g1和c40421_g1表達模式相同，均為上調—下調—下調—下調。只有c53069_g1和c37927_g1這2個基因在S2和S4中表達模式完全一致，其他基因表達模式都有差別，特別是c25618_g1、c32457_g1，c44096_g1和c36613_g1在S2和S4中表達模式差別非常大。

各基因百萬外顯子的堿基片段（FPKM）值差異很大，S2中FPKM值的變化范圍為0.68～537.85，而S4中FPKM值的變化范圍為2.64～632.78。與脅迫處理前相比，脅迫處理后，c53069_g1在S2中的表達量明顯上調，log2（變化表達量）最高達到3.29，而在S4中的多個時間段的比值都超過2.70，最高達到4.99；脅迫處理后c25618_g1在S4中的log2（變化表達量）最高達到 4.15；而c37927_g1在脅迫處理后的某些時間段出現了顯著下調，在S2、S4中的log2（變化表達量）最低分別為-3.08、-2.03。由此可見，不同的FtsH基因在脅迫處理后的表達模式差異很大。

3結論與討論

生物體內的FtsH種類繁多，擬南芥中有12種FtsH蛋白酶，其中AtFtsH3、AtFtsH4和AtFtsH10定位于線粒體，其余9種定位于葉綠體[8]，本研究篩選到的FtsH蛋白酶均定位于葉綠體和線粒體。FtsH參與多種調控途徑，有些FtsH基因與某些生物和非生物脅迫響應密切相關。煙草葉綠體FtsH蛋白同系物DS9與植株抗病性有關，其表達量降低后葉片對病毒侵染產生超敏反應[13]。擬南芥AtFtsH1參與D1蛋白光氧化損傷產物的降解[4]，AtFtsH2和AtFtsH5參與光保護和類囊體發育過程，2個基因突變都會引起葉片花斑和對光抑制敏感性提高[14-15]。定位于葉綠體中的一個苜蓿FtsH基因只受低溫和和光照調控，而不受脫落酸、NaCl或脫水脅迫誘導[9]。來源于番茄葉片組織的LeFtsH6基因也定位于葉綠體，該基因只受熱激脅迫誘導表達，而不受冷害、鹽、干旱或光脅迫誘導，其啟動子中的順式調控元件熱激響應元件（HSE）可以與熱激因子互作[10]。在冰葉日中花中篩選到的FtsH基因可受鹽脅迫表達[11]。由此可見，高等植物中FtsH家族成員功能發生了分化。

為了分析花生中FtsH基因的情況，筆者利用構建的花生葉片轉錄組數據庫，通過生物信息學手段，鑒定出19個FtsH基因，位于花生A組野生種的8條染色體上。聚類分析表明，只有1、2、3、6、8這5個亞家族含有花生FtsH基因，花生的絕大多數FtsH基因可能屬于一些新的亞家族。擬南芥中多個FtsH基因成對存在，有些成對基因之間表達模式相似且功能可以互補，如AtFtsH3和AtFtsH10，AtFtsH2和AtFtsH8，AtFtsH1和AtFtsH5等[8]，而在筆者的試驗中這種現象并不多見，可能是由于筆者獲得的FtsH基因只是來源于葉片組織，而未包括花生全部的FtsH基因。利用花生耐鹽突變體（S2）和對照（S4）構建鹽脅迫處理前后各時間段的表達譜數據，進行基因鹽脅迫表達分析，結果表明，共9個基因在S2和（或）S4中受鹽脅迫誘導表達，絕大多數FtsH基因在耐鹽突變體和對照中的表達模式有較大差異，這些FtsH基因可能在花生抵御鹽脅迫中發揮著重要作用。該結果為進一步研究其功能以及利用它們來改良花生的耐鹽性提供了重要依據。

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