傣藥望江南中的一個新的降倍半萜類化合物及其活性研究

秦瑞欣+左茜++黃蕭涵

[摘要]對傣藥望江南Cassia occidentalis的化學成分進行研究，望江南細枝采用乙醇提取，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物用硅膠柱色譜及PRHPLC制備色譜技術進行多次分離，得到1個降倍半萜3異丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇1和一個倍半萜 2，7二羥基4異丙基6甲基萘1甲醛2，其結構通過譜學數據鑒定?；衔?為新化合物，化合物2也首次從望江南中分離得到。并用 MTT 法測定了化合物1對 NB4，A549，SHSY5Y，PC3，MCF7 5 株人癌細胞株的細胞毒活性，其 IC50分別為（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1。

[關鍵詞]望江南； 降倍半萜； 細胞毒活性

A new norsesquiterpene from Cassia occidentalis and its bioactivity

QIN Ruixin1，2， ZUO Qian1*， HUANG Xiaohan1， MA Hangying 2， YANG Yan2， XING Huanhuan2，

ZHOU Ling2， ZHOU Min2， HU Qiufen2

（1The High School Affiliated to Yunnan Normal University， Kunming 650106， China；

2 Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources， State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education， Yunnan Minzu University， Kunming 650106， China）

[Abstract]The phytochemistry investigation on the Cassia occidentalis， a Dai Medicine， was carried out The C occidentalis was extracted with ethanol and then partitioned with EtOAc The EtOAc soluble materials were subjected repeatedly to column chromatography on silica gel and preparative RPHPLC， leading to isolation of a norsesquiterpene， 3isopropyl1，6dimethoxy5methylnaphthalen7ol （1）， and a sesquiterpene， 2，7dihydroxy4isopropyl6methylnaphthalene1carbaldehyde （2） Their structures were determined by means of spectroscopic studies Compound 1 is a new compound Compound 2 is also isolated from C occidentalis for the first time In addition， the cytotoxicity of compound 1 for NB4， A549， SHSY5Y， PC3， and MCF7 cells line was assayed by using the MTT method， and it displayed potential cytotoxicity for the tested cancer cellline with IC50 valves of （18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1， respectively

[Key words]Cassia occidentalis； norsesquiterpenes； cytotoxic activity

doi：10.4268/cjcmm20162316

望江南Cassia occidentalis Linn為豆科決明屬植物，現廣布于全世界熱帶地區，在我國主要發布在東南部、南部及西南部各省區，是村邊荒地習見植物[1]。該植物為我國傣族民間常用的中草藥，常用作緩瀉劑；種子炒后治瘧疾，根有利尿功效，鮮葉搗碎治毒蛇毒蟲咬傷；葉、根、種子中所含的揮發油，對多種細菌有抑制作用[2]。

目前國內外學者對望江南進行過一些研究，主要報道的化學成分有蒽醌、甾體、黃酮、萜類等類型的化合物[35]，這些化合物表現出抗菌、抗腫瘤、抗瘧疾、抗病毒等多種活性。為充分利用我國豐富的資源，進一步尋找新的活性天然產物，本文對產于西雙版納的望江南細枝化學成分進行了研究，并從中分離到1個降倍半萜類化合物1和1個倍半萜類化合物（2），其中化合物1為新化合物，并且該化合物具有顯著的細胞毒活性?；衔铮?）也首次從望江南中分離到。

1材料

UV2401A 紫外光譜儀 （日本島津公司）；BioRad FTS185 傅里葉變換紅外光譜儀 （美國伯樂BIORAD 公司）；DRX500 型核磁共振儀 （瑞士布魯克公司）；半制備 HPLC 分析儀器為安捷倫公司 1200 型高效液相色譜儀，色譜柱為安捷倫公司 Zorbax PrepHT GF （212 mm ×250 mm， 7 μm）。拌樣時使用 80～100 目硅膠，柱色譜時使用 200～300 目硅膠，薄層色譜用GF254 （100 mm×100 mm） 硅膠板，均為青島海洋化工廠生產；薄層色譜顯色劑為 5% H2SO4乙醇溶液；工業用氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇；實驗用水為超純水。

望江南于 2014年8 月購自云南西雙版納傣醫院，產地為云南西雙版納洲勐臘縣，經西雙版納傣醫院林艷芳主任醫師和云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室楊青松教授鑒定為豆科決明屬植物望江南；植物標本（編號YMU20140822）保存于云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室標本館。

2提取分離

取望江南的細枝 28 kg曬干，粉碎到 30 目，然后用 95% 的乙醇水超聲提取4 次 （每次 30 min，乙醇用量50 L）；提取完后合并提取液并加入500 mL的水，減壓蒸去乙醇；殘余液用乙酸乙酯萃取3次（每次用乙酸乙酯500 mL），合并乙酸乙酯相減壓濃縮得浸膏638 g。浸膏用 60 g （80～100 目） 粗硅膠拌樣，然后用 420 g硅膠 （200～300目） 柱色譜分離，以氯仿丙酮（9∶1， 8∶2， 7∶3， 6∶4， 5∶5， 1∶2） 梯度洗脫，分成 6 個部分。選取 8∶2 洗脫部分進行 HPLC進一步分離：用 Zorbax PrepHT GF （212 mm×250 mm） 反相柱，52% 甲醇為流動相，流速為 20 mL·min-1，收集 286 min 的色譜峰可得化合物1（118 mg）。選取 7∶3 洗脫部分用Zorbax PrepHT GF （212 mm × 250 mm） 反相柱，以40% 甲醇為流動相，流速為 20 mL·min-1，收集 224 min 的色譜峰可得化合物2（154 mg），見圖1。

3結構鑒定

化合物1為淺黃色膠狀物；高分辨質譜 （HRESIMS） 給出準分子離子峰m/z 283130 5 [M+Na]+ （計算值283131 0），結合1H和13 CNMR譜， 推測分子式為C16H20O3，不飽和度為7。紅外光譜數據證實化合物中存在羥基（3 428 cm-1）和芳環（1 610，1 548，1 469 cm-1）功能團，紫外光譜在312，256 nm處有強吸收也證實化合物中存在芳環結構。從1H和13CNMR譜（數據歸屬見表1）信號可以看出化合物中有10個雙鍵碳[C1～10，包括3個次甲基雙鍵碳（C2，C4和C8）]、1個異丙基（C11～13；H11～13）、1個甲基（C14，H14）、2個甲氧基（δC 561 q，614 q；δH 382 s，390 s），以及1個酚羥基（δH 1062）。由于化合物的不飽和度為7（除去10個雙鍵碳的不飽和度5），化合物中還應有2個環；考慮到其他確定的取代基（異丙基、1個甲基、甲氧基和酚羥基）均沒有成環的可能，可初步推測10個雙鍵碳形成了1個萘環。根據H8 （δH 705）和C1 （δC 1551）、C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），H4 （δH 688）和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C5 （δC 1229）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），以及H2 （δH 641）和C1 （δC 1551）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136）、C9 （δC 1217）的HMBC相關見圖 2，可進一步確定化合物中存在萘環結構。并且通過上述核磁共振信號和文獻[6]對比，可證實化合物1為芳構化桉葉烷類型降倍半萜?；衔锏哪负说玫酱_認后，剩余的甲基、異丙基、甲氧基和酚羥基為母核上的取代基。根據H11 （δH 331） 和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136），H12，13 （δH 139）和C3 （δC 1337），以及H2 （δH 641）、H4 （δH 688）和C11 （δC 335）的HMBC相關可證實異丙基取代在萘環的C3位；根據H314 （δH 240）和C5 （δC 1229）、C6 （δC 1517）、C10 （δC 1301）的HMBC相關，可證實該甲基取代在母核的C5位；根據2個甲氧基氫（δH 382 s，390 s）分別和C1 （δC 1551）和C6 （δC 1517）有HMBC相關，可證實2個甲氧基分別取代在母核的C1和C6位；根據酚羥基氫（δH 1062）和C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C8 （δC 1033） 的HMBC相關，可證實酚羥基取代在母核的C7位；而且萘環上典型的氫譜信號[ 705 s，688 （d， J=22 Hz），641 （d， J=22 Hz） ]也支持由HMBC相關證實的取代基位置。至此本化合物的結構得以確定，并命名為3異丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇?；衔铮?）為已知化合物，通過其核磁共振數據和文獻[6]對比被鑒定為2，7二羥基4異丙基6甲基萘1甲醛。

4波譜數據

化合物1淺黃色膠狀物， 分子式為C16H20O3； ESIMS （正離子模式） m/z 283 [M+Na]+； HRESIMS m/z 283130 5 [M+Na]+ （計算值為283131 0），推測分子式為C16H20O3Na。UV （MeOH）λmax （log ε） 312 （362）， 256 （340）， 215 （418） nm； IR （KBr） λmax 3 428， 3 050， 2 942， 1 610， 1 548， 1 469， 1 353， 1 254， 1 207， 1 131，

5化合物的細胞毒活性

對化合物1進行了細胞毒活性篩選。細胞毒活性檢測參照文獻[9]采用改良的 MTT 測定法，以紫杉醇為陽性對照藥，采用了 5 種人源癌細胞株：急性早幼粒細胞白血病細胞（NB4）、人肺腺癌細胞（A549）、人神經母細胞瘤細胞（SHSY5Y）、人前列腺癌細胞（PC3）和人乳腺癌細胞（MCF7），所有腫瘤細胞均購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）。具體實驗步驟如下：收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入 100 μL，鋪板使待測細胞密度調為 1萬/孔。在 5% CO2，37 ℃ 的條件下孵育至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物（設0，02，1，25，5，10 μmol·L-1 6個濃度梯度，每孔 100 μL），繼續在 5% CO2，37 ℃條件下孵育 24～72 h，倒置顯微鏡下觀察。再往每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 g·L-1，即 05% MTT），繼續培養 4 h 后終止培養，小心吸去孔內培養液，接著每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測 A490 nm處測量各孔的吸光值。計算藥物對細胞生長的抑制率。同時設置空白組（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。通過測定藥物在不同濃度下對細胞的抑制率；抑制率=（A空白-A加藥孔）/空白對照A×100%；并采用改良寇式法計算IC50。每個化合物平行測定3次，結果取平均值，測定結果為：紫杉醇的 IC50分別為003， 002， 005， 005， 003 μmol·L-1，化合物 1 的 IC50分別為（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1，結果表明化合物 1 對所測試的人源腫瘤細胞增殖具有細胞毒活性。

[參考文獻]

[1]吳征鎰，陳書坤 云南植物志第8卷 [M] 北京： 科學出版社， 1997

[2]張薔蓉 簡述決明屬中草藥[J] 中草藥， 2005， 36（6）： 955

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[6]Zhang Y， Liu Y B， Li Y， et al Sesquiterpenes and alkaloids from the roots of Alangium chinense [J] J Nat Prod， 2013， 76（6）： 1058.

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[責任編輯丁廣治]