基于滸苔暴發海水池塘的微生物生態特征研究

王春忠，孫富林，侯代云，肖懿哲，林國榮，嚴濤

(1. 福建省莆田市水產科學研究所，福建 莆田351100；2. 中國科學院 南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3. 91329部隊，山東 威海 264200；4. 莆田學院 環境與生物工程學院，福建 莆田351100)

基于滸苔暴發海水池塘的微生物生態特征研究

王春忠1，孫富林2，侯代云3，肖懿哲1，林國榮4，嚴濤2

(1. 福建省莆田市水產科學研究所，福建 莆田351100；2. 中國科學院 南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3. 91329部隊，山東 威海 264200；4. 莆田學院 環境與生物工程學院，福建 莆田351100)

為研究滸苔對海水養殖環境微生物生態的影響，采用Illumia高通量測序技術測定冬季墾區進水區、滸苔暴發的池塘和排水區水體以及底泥中菌群結構，分析進水區、池塘養殖區和排水區的環境微生物結構演變過程。結果表明:(1)γ-變形細菌、α-變形細菌、放線菌、擬桿菌和δ-變形細菌為海水養殖區的優勢細菌門類；(2)進水區水體和底泥微生物種類和多樣性指數均高于滸苔池塘和排水區；滸苔暴發的池塘和排水區微生物群落結構較為相似； (3)滸苔池塘的水體微生物以異養細菌為主，底泥以脫硫桿菌等厭氧細菌為主，增加了底泥潛在產生硫化氫的危害；(4)進水區水體含有豐度較高的弧菌和魚立克次氏體等條件致病性病原菌，而滸苔池塘中含量較低，說明滸苔對弧菌等有一定的抑制作用；但滸苔暴發的池塘和排水區中另一種潛在致病菌黃桿菌類的豐度較高，養殖品種務必防患此類病菌感染疾病的發生。本文從微生態學角度全面揭示滸苔對近岸海區、海水池塘和排水區微生態演變過程的影響，發現了滸苔具有抑制和增加不同致病菌的雙重作用，這對水產養殖有一定指導，也為滸苔發生原因、預報、預防等研究提供一定理論參考。

滸苔；高通量測序；細菌群落；弧菌；魚立克次氏體；黃桿菌

1 引言

滸苔是綠藻綱石莼科的一屬。近年來，在中國沿岸海域暴發滸苔綠潮造成危害的現象變得越來越頻繁，呈現規模大、危害重、持續時間長等特點，對沿海景觀、生態環境、漁業生產和濱海旅游造成影響，已經成為一種海洋災害。僅2008年黃海海域的暴發，覆蓋面積大約650 km2[1]，造成了13.22億人民幣直接經濟損失[2]。滸苔在養殖池塘中大量發生嚴重消耗水體營養物質，抑制單胞藻繁殖，影響池塘貝類生長；蓋住灘面造成底部貝類窒息，死亡的滸苔會消耗海水中的氧氣。綠色的藻類大量繁殖，通常與遮陽、生物分解、缺氧相關[3]，影響或改變生態系統功能和結構[4]。微生物群落在水體生態系統中發揮著重要作用，同水體的生產力、養分循環、養殖動物的營養，以及宿主動物抗病密切相聯系[5—7]。

目前國內外對滸苔的生理、生態研究表明，滸苔生長繁殖在秋轉冬時，此時水溫逐步下降，經過孢子發育形成具有假根附著固著物葉狀體分化形成個體，在冬轉春夏時隨著水溫升高，脫離固著物漂浮水面后進行營養繁殖和生殖生長聚集，并漂浮海面形成綠潮[8—10]。研究滸苔附著階段的環境微生物群落特征及其影響顯得尤其重要。本實驗在福建莆田地區固著池塘底質的滸苔達到全年高峰時，通過Illumia高通量測序技術測定海水進水區、滸苔覆蓋的池塘以及排水區的水體和底泥中菌群結構，了解分析滸苔生長池塘、進水區和排水區的環境微生物結構演變特征，揭示滸苔對海水池塘養殖生產、海區微生物的影響，為滸苔發生原因、預報、預防和近海養殖生態的研究提供一定理論參考。

2 材料和方法

2.1 采樣地點與時間

樣品于2015年12月采集自福建省莆田市北江墾區對蝦養殖區，每個養殖池面積3.33 hm2，平均水深1 m，泥沙底質，泥∶沙比例為81∶19，混養硬殼蛤(Mercenariamercenaria)和日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)。滸苔主要種類為滸苔屬(Enteromorpha)，覆蓋整個池塘近1/3。養殖進水區水體無滸苔，排水區也長有大量滸苔。采用抓斗式采泥器采集底泥樣品，無菌采集0～4 cm 泥樣。水體用有機玻璃采水器采集，先預過濾除去大顆粒物質，再用孔徑為0.2 μm的聚碳酸酯膜過濾500 mL，將濾膜用錫箔紙包好保存。所有樣品保存于-80℃超低溫冰箱以備DNA 提取。

2.2 DNA 提取及IlluminaMiSeq平臺測序

無菌條件下取出濾膜，剪碎后放置于1.5 mL離心管中, 水樣濾膜的提取參照之前的方法[11]。稱取1 g (濕質量) 底泥樣品，參照土壤核酸提取試劑盒(OMEGA公司)說明步驟提取總DNA。本實驗16S rRNA測序以V3和V4為目標區域進行引物設計，引物序列為319F (5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3′) 和 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)，擴增片段大小大約469 bp；使用水樣和底泥的DNA模板50 ng，25 μL的PCR體系，使用Phusion酶擴增30個循環。PCR 反應條件為95℃預變性3 min； 95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s； 72℃延伸10 min。在正反引物兩段加上不同的barcode以區分不同的樣品，擴增完成后的PCR產物使用beads純化之后進行上機測序。

2.3 數據分析

對于Miseq測序獲得的雙端數據，首先根據barcode信息進行樣品區分，然后根據overlap關系進行拼接，隨后進行Q20、Q30等質控分析，對最終獲得clean數據歸一化之后進行OTU聚類分析和物種分類學分析。采用CD-HIT工具將序列相似性大于97%的Tags定義為一個OTUs操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚類。采用Qiime軟件對樣品序列進行Alpha多樣性分析，包括物種數目(observed species)、Shannon指數(Shannon Index)、Chao1指數(Chaos1 Index)。選擇OTUs操作單元里的一條代表序列(默認豐度最高)采用RDP classifier軟件進行物種分類，分類閾值默認為0.8。利用PAST軟件對微生物群落結構進行除趨勢對應分析(DCA)，揭示微生物種類與環境樣品間的關系。

3 結果分析

3.1 高通量測序數據

通過IlluminaMiSeq測序，總共測定出355 996條序列，在97%相似性水平為標準觀測到14 418個物種，各樣本結果見表1。結果顯示底泥微生物數量高于水體；進水區水體(LZ3)、底泥(YN3)微生物種類和多樣性要分別高于滸苔池養殖池(LZ6、YN6)和排水區(LZ5、YN5)。養殖池水體的豐富度指數chao1顯著低于進水區水體，而底泥豐富度指數和進水區相差不大。

表1 基于高通量測序分析的細菌生態多樣性指數

3.2 養殖系統微生物群落結構分析

通過對樣品微生物種類信息進行注釋，比較不同樣品所對應的微生物種類在樣品中的豐度信息。由圖1所示，從細菌門分類水平分析，γ-變形細菌(Gammaproteobacteria)、α-變形細菌(Alphaproteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidete)和δ-變形細菌(Deltaproteobacteria)是優勢細菌門類。進水區水體微生物以γ-變形細菌(Gammaproteobacteria，45.71%)和α-變形細菌(Alphaproteobacteria，16.55%)為主，底泥以γ-變形細菌(Gammaproteobacteria，45.82%)和δ-變形細菌(Deltaproteobacteria，17.33%)為主。滸苔池塘水體以放線菌(Actinobacteria，50.58%)、α-變形細菌(Alphaproteobacteria，10.16%)、擬桿菌(Bacteroidetes，26.10%)為主，底泥以γ-變形細菌(Gammaproteobacteria，20.28%)和δ-變形細菌(Deltaproteobacteria，27.99%)為主；排水區水體以放線菌(Actinobacteria，32.35%)、α-變形細菌(Alphaproteobacteria，27.41%)，擬桿菌(Bacteroidetes，25.21%)為主，底泥以γ-變形細菌(Gammaproteobacteria，25.67%)和δ-變形細菌(Deltaproteobacteria，25.29%)為主。

圖1 在門分類水平樣品中細菌種群結構及其相對豐度Fig.1 Bacterial communities found between the source in bacterial phylum level

圖2 在目分類水平樣品中細菌種群結構及其相對豐度Fig.2 Bacterial communities found between the samples in bacterial order level

圖3 在屬分類水平樣品中細菌種群結構及其相對豐度Fig.3 Bacterial communities found between the source in bacterial genus level

從圖2目分類水平分析，樣品之間微生物種類差異更為明顯(ANOVA，P<0.01)。以相對豐度大于5%計算，進水水體微生物優勢種類為Alteromonadales(13.10%)、Rhodobacterales(12.97%)、Oceanospirillales(5.80%)、Actinomycetales(5.55%)、Flavobacteriales(5.51%)；底泥微生物優勢種類為Thiotrichales(10.02%)、Desulfobacterales(7.16%)、Alteromonadales(6.27%)、Chromatiales(5.42%)。滸苔池塘水體微生物優勢種類為分別為Actinomycetales(50.29%)、Flavobacteriales(25.11%)、Rhodobacterales(4.79%)；底泥微生物以Desulfobacterales(21.07%)、Campylobacterales(5.56%)、Thiotrichales(3.34%)、Chromatiales(1.59%)為主。排水區水體微生物優勢種類分別為Actinomycetales(28.17%)、Flavobacteriales(23.56%)、Rhodobacterales(23.02%)；底泥微生物以Desulfobacterales(16.61%)、Campylobacterales(8.49%)、Thiotrichales(5.98%)、Chromatiales(5.68%)為主。

從圖3屬分類水平分析，進水區水體微生物以Vibrio(8.24%)、Rhodobacteraceae(7.97%)、Gammaproteobacteria(4.46%)為主；底泥以Gammaproteobacteria(10.43%)、Piscirickettsiaceae(9.48%)、Chromatiales(4.16%)為主。滸苔池塘水體微生物以Rhodobacteraceae(4.01%)、Actinomycetales(15.15%)、Microbacteriaceae(11.87%)、CandidatusAquiluna(23.02%)、Sediminicola(1.78%)為主；底泥LZ6以Desulfopila(6.19%)、Desulfobacteraceae(5.29%)、Sulfurovum(5.28%)、Marinicellaceae(4.83%)、Desulfobulbaceae(3.87%)為主。排水區微生物以Rhodobacteraceae(14.41%)、Actinomycetales(9.96%)、Microbacteriaceae(9.17%)、CandidatusAquiluna(8.64%)、Sediminicola(6.57%)為主；底泥LZ5以Sulfurovum(8.15%)、Gammaproteobacteria(5.99%)、Chromatiales(5.37%)、Desulfococcus(4.79%)為主。

3.3 微生物群落結構的對應分析

為了更好的理解樣品與微生物類群之間的關系，除趨勢對應分析(DCA)用來表觀微生物群落間的差異與相似性(圖4)。排序圖表明了細菌在屬分類水平同樣品間的聯系。模型的第一和第二特征值為0.734 8和0.101 8。從圖上可以看出，滸苔覆蓋水體樣品(LZ5、LZ6；YN5、YN6)分別相似，距離較近；進水區樣品同它們差異大，相距較遠，樣品間共有的細菌種類較少。滸苔覆蓋水體以CandidatusAquiluna、Actinomycetales、Microbacteriaceae、Lishizhenia、Flavobacterium等異養細菌為特征微生物種類，沉積物以Desulfopila、Desulfobacteraceae、Desulfobulbaceae、Desulfuromonadaceae和Desulfococcus等厭氧性硫還原細菌為特征微生物種類。

圖4 樣品間微生物群落的對應分析Fig.4 Correspondence analysis of bacterial communities generated

圖5 樣品間優勢OTU分布特征Fig.5 Rank abundance histograms for the top OTUs

表2 各樣品中細菌豐富度最高的10個OTUs(括號內為各OTU相對豐度，%)

3.4 優勢OTU分析

為了更詳細分析滸苔對微生物的影響，分析了44個優勢OTU(豐度大于1%)的分布特征。圖5表明水體和底泥樣品具有顯著的微生物差異；進水區與滸苔爆發的池塘、排水區水體的優勢OTU差異顯著(ANOVA，P<0.01)；同樣是滸苔覆蓋的區域，優勢的OTU種類在養殖池中的豐度要高于排水區。對不同樣品中所含菌群豐度最高的10個OTUs的研究有助于了解樣品中所含的主要細菌類型和其生態功能，表2體現了主要樣品間主要物種豐度和種類變化。經序列比對發現主要的種類組成為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門的細菌。同進水區水體相比，滸苔覆蓋的池塘和排水區水體具有較高的異養細菌如Microbacteriaceae、CandidatusAquilunarubra、Flavobacteriales等；底泥具有較高豐度的厭氧細菌如Desulfopila、Desulfobacteraceae、Desulfobulbaceae、Desulfuromonadaceae、Desulfococcus等。這些微生物群落結構充分體現了滸苔對微生物生態結構和功能的影響。

4 討論

本文分析了海水墾區養殖區滸苔暴發時水體及底泥的微生物群落狀況，并與進水區微生物群落進行比較。通過illumia平臺的高通量測序，詳盡的分析了它們的微生物組成、多樣性以及遺傳進化信息。結果表明樣品中優勢細菌為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、藍細菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和芽單胞菌門等24個類群，總共355 996條序列被測定，在97%相似性水平為標準觀測到14 418個物種，而之前采用16S rRNA基因克隆文庫的方法在養殖區檢測獲得到的物種數為133和212[11—12]，類群為7和11個門類；基于Illumina Miseq平臺的高通量測序在本實驗中測定了幾十萬條序列，序列覆蓋范圍和數量相比于傳統方法更廣更多，更能全面反應微生物的多樣性特性，為深入研究海洋微生物群落特征提供了極大可能，因此高通量測序分析是了解海水養殖環境中菌群多樣性的一種有效研究手段。

底泥中微生物多樣性較水體類型中微生物多樣性較高，可能與底泥高度的分層特性以及化學梯度相關[13]。同進水區比較，滸苔池塘和滸苔覆蓋的排水區的微生物組成物種的種類和多樣性都要低，這與Chrzanowski等[14]研究發現相一致，在相對較低的營養條件下，細菌的多樣性會增加，而當營養水平較高趨近富營養化時，會抑制對環境敏感的細菌的生長，水體中細菌群落多樣性表現為減少的趨勢。

滸苔水體含有較高的異養細菌Actinomycetales和Flavobacteriales。Actinomycetales主要包括Actinomycetales、Microbacteriaceae、CandidatusAquiluna。尤其是CandidatusAquiluna的相對豐度高達23.02%，并與CandidatusAquilunarubra具有99%的相似度。CandidatusAquilunarubra代表一類革蘭氏陽性、好氧、攜帶actinorhodopsin光合異養菌[15—16]。滸苔暴發后一定時間之內可能會導致養殖池中有機物含量增加，異養細菌很容易從滸苔棲息地獲取可利用的溶解性有機碳[17]，誘發異養細菌豐度的增加。這與之前報道微型底棲生物在大型藻類環境中主要為異養細菌[18—19]的結果相一致。

本研究發現滸苔不僅增加異養菌的豐度，也增加了黃桿菌等潛在致病菌在水體中的豐度，同他人研究中滸苔腐爛過程中黃桿菌是占優勢的微生物群落結果相似[19]。但黃桿菌在滸苔池塘中蝦和蛤的腸道含量較低，幾乎沒有測定出(另文報道)。本實驗中黃桿菌優勢的微生物種類是Sediminicola、Flavobacteriales、Tenacibaculum、Owenweeksia和Winogradskyella。Sediminicola的細菌Sediminicolaluteus能還原硝酸鹽和降解明膠、酪蛋白和淀粉等[20]。而黃桿菌的很多種類也是潛在的致病菌，如黃桿菌屬(Flavobacterium)的幾個種類導致引起人類肺炎、腦膜炎、敗血癥等感染[21—22]；一些種類對淡水魚類有致病作用[23—24]，患病魚體會出現爛鰓、體表潰瘍、組織壞死及鰭條腐爛等癥狀，死亡率可高達100%，全球每年因黃桿菌引發的柱形病感染引起淡水魚類發病死亡所造成的經濟損失極其嚴重[25]。Tenacibaculum常常分離在大型綠藻，是一種潰瘍性疾病稱為滑動細菌病或tenacibaculosis的病原體[26]，這種病原菌導致高死亡率，增加其他病原體的易感性[27]。至于海水中黃桿菌對人類和海水中魚、蝦、貝是否潛在的致病作用有亟待進一步研究。滸苔池塘底泥Desulfopila和Desulfobacteraceae等硫還原細菌等含量較高 (Desulfobacterales和Desulfuromonadales, 大于20%)。Desulfobacterales和Desulfuromonadales是嚴格厭氧硫還原細菌，能還原硫酸鹽獲得能量，產生硫化氫，Desulfobacterales也被確定為在水產養殖沉積物中主要的硫酸鹽還原菌。Asami 和 Kondo等使用特定引物擴增16SrRNA基因以及亞硫酸還原酶功能基因和測序，證明硫循環在硫還原細菌在貝類養殖沉積物中比較豐富[28—29]。這些研究結果表明，在滸苔影響下養殖池產生低氧或缺氧，并增加厭氧細菌豐度；這些硫酸鹽還原菌可在缺氧條件下轉化生成硫化氫，對水產動物和環境造成嚴重的危害。

弧菌是海洋環境中最常見的細菌類群之一，廣泛分布于近岸、河口海區的海水和生物體中，是一類條件致病菌, 可引起養殖對象出現皮膚潰瘍、爛尾、爛鰭、出血等癥狀, 導致養殖動物對外界反應遲鈍, 攝食率下降或停止攝食等。魚立克次氏體Piscirickettsiaceae中的一些種類如Piscirickettsia，是魚類(鮭魚、海鱸魚等)的致病菌[30—31]；受感染的魚類會聚集在養殖籠的表面，變得行動遲緩和沒有食欲。本研究發現，進水區含有較高豐度的弧菌和魚立克次氏體等潛在致病菌，但是在滸苔覆蓋的池塘和排水區，其在水體中含量變得很低。有研究表明滸苔多糖提高對弧菌V.splendidus的抗性，降低海參的死亡率[32]；滸苔抗性物質合成的納米顆粒也具有顯著的體外抗菌活性，對革蘭氏陽性菌類具有很高的抑制作用[33]；提取的滸苔精油能沉積在胞漿內或通過酶法降解細胞胞內酶，誘導細胞膜結構的損壞，從而導致細胞裂解，具有很強的自然抗菌活性，能對革蘭氏陰性菌如E.coli和S.typhimurium起到明顯的抑制作用[34]。滸苔爆發會增加黃桿菌類致病菌和產硫化氫等厭氧硫還原細菌的豐度，同時也會抑制弧菌等潛在致病菌的增殖，具有兩重性。因此，在存有大量滸苔池塘或海區，為了保證養殖水生生物的健康生長，不僅應密切關注水體硫化氫等水質指標，加強養殖管理，采取相關措施提高水體溶解氧，而且要防患黃桿菌這類致病菌感染引發疾病的發生。

5 結論

綜上所述, 本研究采用高通量測序研究在滸苔爆發期間養殖池細菌群落結構的變化，結果顯示微生物生態結構的變化與滸苔密切相關。滸苔影響下水體和沉積物形成自己特征性細菌類群；滸苔水體微生物以異養細菌為主，主要是放線菌和黃桿菌類群；沉積物以厭氧細菌為主，主要是硫還原細菌。另一方面滸苔對弧菌以及魚立克次氏體有抑制作用，使得這些致病菌在養殖池中的豐度減少；但是滸苔暴發增加了黃桿菌類潛在致病菌的豐度，要做好這類致病菌的預防及防治工作。本研究揭示滸苔對海水池塘養殖生產、海區微生物的影響，為滸苔發生原因、預報、預防的研究提供一定理論參考。

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Study on the microbial characteristics of seawater pond based onEnteromorphabloom

Wang Chunzhong1, Sun Fulin2, Hou Daiyun3, Xiao Yizhe1, Lin Guoron4, Yan Tao2

(1.PutianInstituteofAquacultureScienceofFujianProvince,Putian351100,China; 2.SouthChinaSeaInstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510301,China; 3.PLA91329Unit,Weihai264200,China; 4.CollegeofEnvironmentandBiologicalEngineering,PutianUniversity,Putian351100,China)

In order to explore the effect ofEnteromorphabloom on the bacterial community, Illumina MiSeq Sequencing was used to investigate the bacterial structure in source water, culture pond and drainage area in this study. The results showed that Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidete and Deltaproteobacteria were the dominant bacteria groups in aquaculture water. Bacterial community in source water had higher in species numbers and Shannon diversity than pond and drainage area withEnteromorpha. Furthermore, pond and drainage area withEnteromorphawas dominated by heterotrophic bacteria in water (mainly Actinomycetales and Flavobacteriales), as well as by anaerobic bacteria in underlying sediment (mainly Desulfobacterales), which increased potential ability to produce hydrogen sulfide. Source water contained high abundance of conditional pathogenic microbe, such as vibrio and Piscirickettsiaceae; whereas little was detected inEnteromorpha-containing pond,which indicated thatEnteromorphahad strong inhibitory effect on these pathogens. In addition,Enteromorphaalso increased the abundance of Flavobacterium in pond and drainage areas; some genera of Flavobacterium are conditional pathogenic bacteria for aquaculture animal, and need pay attention to prevent such infections disease.Enteromorphahas the dual role to inhibit or increase abundance of different pathogens, and have importance effect to aquaculture. Overall, massive growth ofEnteromorphawould produce the significant effect on the bacterial community, and have serious impact on the coastal environment. This study explored the novel findings of the microbial community relevant toEnteromorpha, and will provide guidance for the prevention and control of the green tide.

Enteromorpha; Illumina MiSeq Sequencing; bacterial community; vibrio; piscirickettsiaceae; flavobacterium

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.04.011

2016-07-19；

2016-08-31。

國家青年科學基金項目(41406130)；國家星火計劃項目(2015GA720002)；福建省科技計劃項目(2015N0013，2016I1002)；廣東科技項目(2016A020221024)。

王春忠(1969—)，男，福建省莆田市人，研究員，主要從事水產養殖及其環境生態學研究。E-mail: ptwcz@163.com

Q938.1

A

0253-4193(2017)04-0107-10

王春忠，孫富林，侯代云，等. 基于滸苔暴發海水池塘的微生物生態特征研究[J].海洋學報，2017，39(4)：107—116,

Wang Chunzhong, Sun Fulin, Hou Daiyun, et al. Study on the microbial characteristics of seawater pond based onEnteromorphabloom[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(4)：107—116, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.04.011