靶向肝癌細胞自噬提高大黃素的毒性殺傷作用

黨中峰，何科基，那光瑋，孫文平，程永生，王維君，李 瑞

甘肅省腫瘤醫院腹外二科，甘肅 蘭州 730050

靶向肝癌細胞自噬提高大黃素的毒性殺傷作用

黨中峰，何科基，那光瑋，孫文平，程永生，王維君，李 瑞

甘肅省腫瘤醫院腹外二科，甘肅 蘭州 730050

背景與目的：大黃素處理肝癌細胞后能夠誘導內質網應激和凋亡。鑒于內質網應激與自噬之間的關聯及后者作為細胞對抗應激環境的一種自我防御機制，該研究擬探討通過抑制肝癌細胞自噬信號通路的策略提高大黃素對腫瘤細胞的毒性殺傷作用。方法：大黃素處理肝癌細胞后，應用CYTO-ID自噬檢測試劑盒和蛋白［質］印跡法(Western blot)分別檢測大黃素誘發細胞自噬情況；利用細胞自噬抑制劑(氯喹)預先抑制肝癌細胞自噬的產生，然后用大黃素處理肝癌細胞，最后通過ATPlite試驗和細胞克隆形成實驗檢測腫瘤細胞存活；通過流式細胞術檢測氯喹和大黃素聯合處理誘導肝癌細胞發生凋亡的凋亡率，采用Western blot檢測凋亡效應蛋白caspase-3活化斷裂后產生活性片段的水平。結果：大黃素處理肝癌細胞后能夠誘導肝癌細胞自噬；利用氯喹抑制肝癌細胞自噬能夠顯著能夠提高大黃素對肝癌細胞克隆存活的抑制作用；氯喹和大黃素聯合處理肝癌細胞能夠顯著提高細胞周期sub-G1期和活化caspase-3蛋白的表達水平。結論：靶向肝癌細胞自噬能夠提高大黃素的毒性殺傷作用。

大黃素；細胞自噬；肝癌細胞；細胞凋亡

肝癌是我國多發的一種惡性消化系統腫瘤。因其惡性程度高、病程進展快，患者確診后往往已喪失手術治療的機會。由于肝癌對常規化療藥物及靶向藥物不敏感，同時容易產生耐藥性，目前可供臨床肝細胞癌治療用的藥物極其有限。中草藥因其廣譜的抗腫瘤效果及低毒特點，近年來逐漸受到國際關注。其中，來源于中藥大黃的大黃素單體化合物已在臨床前模型層面被證實具有一定的抗肝癌治療效果，成為抗肝癌藥物研究領域的新嘗試［1］。為了進一步提高大黃素的抗肝癌治療效果，本研究擬從聯合用藥的角度探尋提高大黃素臨床療效的潛在策略。

細胞自噬是哺乳動物細胞通過其溶酶體自我消化的一個代謝過程，通常被認為是細胞在營養缺乏或其他外界應激條件下誘發的一個自我保護機制［2］。迄今，細胞自噬通路已被證實是多種惡性腫瘤的治療靶點。同時，大量研究發現，通過靶向細胞自噬通路也可以顯著提高其他抗腫瘤藥物的治療效果［3］。在前期工作中，我們發現大黃素處理肝癌細胞后能夠誘導內質網應激和細胞凋亡［4］。鑒于內質網應激與細胞自噬之間的內在關聯［5］，我們推測大黃素處理肝癌細胞后能夠激活細胞自噬通路，后者作為細胞對抗應激環境的重要機制，能夠促進腫瘤細胞存活?；诖?，本研究擬通過一系列實驗驗證靶向肝癌細胞自噬信號通路提高大黃素對腫瘤細胞的毒性殺傷效果。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

大黃素購自中國藥品生物制品檢定所，純度大于98%；細胞培養基DMEM購自美國Corning公司；CYTO-ID自噬檢測試劑盒購自美國Enzo Life Sciences公司；氯喹購自美國Selleck Chemicals公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液購自美國Yeasen公司；Cleavedcaspase3、β-actin抗體購自美國Cell signaling公司；抗LC3A/B抗體購自美國Abcam公司；細胞存活率ATPlite檢測試劑盒購自美國PerkinElmer公司。

人肝癌HepG2和Huh7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。兩種細胞均用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液進行培養，其培養條件為37 ℃、CO2體積分數為5%的飽和濕度。當細胞處于對數生長期時即用于后續實驗。

1.3 細胞自噬的檢測

細胞自噬用CYTO-ID自噬檢測試劑盒進行檢測，具體實驗方法嚴格按照產品使用說明書進行，其步驟如下：當細胞長到50%～70%匯合度后，棄上清液，直接添加CYTO-ID自噬檢測染料和細胞核染料Hoechst 33342，然后在37 ℃條件下活染20 min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照；同時通過蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測細胞自噬標記蛋白LC3-Ⅱ的表達。

1.4 細胞增殖實驗

采用適當藥物處理生長狀態良好的腫瘤細胞后，接種于96孔培養板(每孔2 000個細胞)上，然后繼續培養72 h，最后按照產品使用說明書使用ATPlite試劑盒檢測細胞的存活率。

1.5 細胞克隆形成實驗

將處于生長對數期的人肝癌HepG2、Huh7細胞分別接種于直徑為6 cm的培養皿，每個培養皿接種400個細胞。第2天在培養皿中添加氯喹、大黃素或兩者聯合處理，陰性對照用0.1% DMSO處理。細胞繼續培養10～14 d后用含有0.1%結晶紫的染色液進行固定與染色。按含有50個細胞以上的細胞克隆為陽性克隆，在普通光學顯微鏡下觀察并計算細胞克隆形成情況。

1.6 流式細胞儀分析

根據以上均值方程的殘差平方序列偏相關函數(表3)，ARCH-LM檢驗滯后期選擇10期。根據以上ARCH-LM檢驗結果，F統計量和卡方統計量的伴隨概率均小于0.05，因此ARCH-LM檢驗表明收益率序列存在ARCH效應，也就是存在自回歸條件異方差特性。[4]

用濃度為0.025%的胰酶充分消化細胞，以300×g的速度離心5 min收集細胞；用PBS(pH為7.4)清洗細胞后用70%乙醇進行固定，置冰上放置30 min以上；用適量PBS(pH為7.4)清洗后，按照使用說明書添加適量PI染色液，輕柔混勻，置室溫避光溫育15 min后，供流式細胞儀分析細胞周期。

1.7 Western blot檢測

腫瘤細胞經過藥物處理后，用細胞刮子直接刮下細胞，300 ×g離心5 min后收集細胞沉淀；添加適量RIPA裂解液(含50 mmol/L Tris pH為7.4，150 mmol/L氯化鈉，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS)進行重懸，置冰上放置15 min；在4 ℃條件下18 000×g離心10 min，收集上清液并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品的濃度。蛋白樣本經煮沸變性后供SDS-PAGE分離；電泳完畢后將蛋白通過半干法轉移至硝酸纖維素膜上，先后經過膜封閉、一抗和二抗結合等實驗步驟后進行化學發光顯影。

1.8 統計學處理

利用Graph pad 5.0軟件包進行統計學分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大黃素能夠誘導肝癌細胞自噬

本研究的前期工作證實，大黃素抑制肝癌細胞的效果呈劑量依賴性。其中大黃素在濃度為100 μmol/L的條件下處理細胞48 h，能夠抑制大約30%腫瘤細胞的增殖［4］。在此基礎上，本實驗預先用大黃素(100 μmol/L)處理肝細胞癌細胞株HepG2，然后檢測細胞自噬情況。結果發現大黃素處理細胞后24 h，不但能夠誘發大量自噬泡的產生(圖1B)，而且可以提高細胞自噬標記蛋白LC3-II的表達(圖1C)，表明該化合物能夠顯著誘導肝癌細胞自噬。盡管克隆形成試驗發現，大黃素(100 μmol/L)處理細胞24 h僅能夠抑制部分腫瘤細胞的克隆存活(圖1D)，但鑒于細胞自噬是細胞抵抗外界應激環境的一種自我保護機制，我們推測肝癌細胞自噬參與抑制大黃素所誘導的腫瘤細胞毒性效應。因此，抑制腫瘤細胞自噬可能有助于促進大黃素對腫瘤細胞的殺傷作用。

2.2 抑制自噬通路提高大黃素對肝癌細胞克隆存活的抑制作用

為了驗證靶向細胞自噬對大黃素抑制肝癌細胞生長的效果，我們首先利用氯喹預先抑制細胞自噬的發生，然后用大黃素處理肝癌細胞。結果發現，當使用氯喹(10 μmol/L)阻斷腫瘤細胞自噬通路后(圖2A)，大黃素能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖(圖2B)及克隆存活(圖2C)，提示自噬通路可以作為提高大黃素抗肝癌治療效果的潛在增效靶點。

圖 1 大黃素誘導肝癌細胞自噬Fig. 1 Emodin induced autophagy in liver cancer cells

2.3 抑制自噬顯著促進大黃素誘導的肝癌細胞凋亡

在前期工作中，我們證實了大黃素能夠誘導肝癌細胞凋亡［2］。鑒于上述實驗結果發現，氯喹和大黃素聯合應用能夠顯著抑制腫瘤細胞的存活，我們擬進一步評價氯喹和大黃素聯合作用對肝癌細胞凋亡的影響。首先通過流式細胞儀分析技術發現氯喹和大黃素聯合處理腫瘤細胞能夠顯著提高細胞周期的sub-G1期，提示兩者聯合作用后可以促進腫瘤細胞凋亡(圖3A)。為驗證以上實驗結果，我們通過Western blot檢測細胞cleaved-caspase3蛋白的表達，結果發現，氯喹和大黃素聯合處理腫瘤細胞后能夠顯著提高cleaved-caspase3蛋白水平(圖3B)，從而表明以上兩種藥物聯合作用能夠顯著促進腫瘤細胞凋亡。

圖 2 抑制細胞自噬提高大黃素對肝癌細胞的抑制作用Fig. 2 Inhibition of autophagy enhanced the inhibitory effect of emodin on liver cancer cells

圖 3 抑制細胞自噬顯著促進大黃素誘導肝癌細胞凋亡Fig. 3 Blockage of autophagy significantly promoted emodin-induced apoptosis in liver cancer cells

3 討 論

在前期工作中，我們發現大黃素能夠誘導肝癌細胞產生內質網應激并導致腫瘤細胞凋亡［4］。但值得關注的是，大量研究發現內質網應激能夠通過錯綜復雜的細胞信號通路誘發細胞自噬。后者作為哺乳細胞抵抗細胞內外不良環境的生理反應，已被證實與腫瘤細胞耐藥機制密切相關［3］。為了探索細胞自噬與大黃素的抑瘤效應之間的潛在關聯，本研究以肝癌細胞株為研究模型，首先確認大黃素處理肝癌細胞后能夠顯著刺激肝癌細胞產生自噬現象?；谶@一實驗基礎，我們后續進一步證實通過氯喹抑制肝癌細胞自噬后能夠顯著促進大黃素誘導肝癌細胞凋亡。

事實上，大量研究已證實通過抑制細胞自噬能夠提高多種類型腫瘤對化療藥物的敏感性，其涉及機制多樣、復雜［6-7］。雖然本研究從細胞水平證實了靶向細胞自噬也能夠提高大黃素對肝癌細胞的抑制作用，同時這種抑制效應與細胞凋亡密切相關，但對其中的作用分子機制及動物模型層面的評估尚未進一步研究。這將是本項目今后需要解決的重要問題。本研究探索通過靶向細胞自噬提高大黃素抑制肝癌細胞生長效果的潛在治療策略將具有一定的臨床應用價值。

［1］ MANU K A, SHANMUGAM M K, ONG T H, et al. Emodin suppresses migration and invasion through the modulation of CXCR4 expression in an orthotopic model of human hepatocellular carcinoma［J］. PLoS One, 2013, 8(3): e57015.

［2］ WHITE E. The role for autophagy in cancer［J］. J Clin Invest, 2015, 125(1): 42-46.

［3］ YANG Z J, CHEE C E, HUANG S, et al. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications［J］. Mol Cancer Ther, 2011, 10(9): 1533-1541.

［4］ 黨中峰, 黨雅梅, 陳 城, 等. 大黃素誘導對內質網應激相關蛋白表達及肝癌HepG2細胞凋亡的影響［J］. 蘭州大學學報: 醫學版, 2015, 41(2): 50-54.

［5］ RASHID H O, YADAV R K, KIM H R, et al. ER stress: Autophagy induction, inhibition and selection［J］. Autophagy, 2015, 11(11): 1956-1977.

［6］ YANG M C, WANG H C, HOU Y C, et al. Blockade of autophagy reduces pancreatic cancer stem cell activity and potentiates the tumoricidal effect of gemcitabine［J］. Mol Cancer, 2015, 14(1): 179.

［7］ CHEN P, HU T, LIANG Y, et al. Synergistic inhibition of autophagy and neddylation pathways as a novel therapeutic approach for targeting liver cancer［J］. Oncotarget, 2015, 20, 6(11): 9002-9017.

Therapeutically targeting autophagy enhances cytotoxicity of emodin in liver cancer cell lines

DANG Zhongfeng, HE Keji, NA Guangwei, SUN Wenping, CHENG Yongsheng, WANG Weijun, LI Rui (Second Department of Abdominal Surgery, Gansu Provincial Tumor Hospital, Lanzhou 730050, Gansu Province, China)

HE Keji E-mail: 13893265154@163.com

Background and purpose: The previous work of this study has showed that the treatment of liver cancer cells with emodin could induce endoplasmic reticulum (ER) stress and apoptosis. Given the cross-talk between ER stress and autophagy, this study aimed to investigate whether blockage of autophagy, a defense mechanism against environmental stress, could improve the killing effect of emodin on liver cancer cells. Methods: The CYTO-ID autophagy detection kit and Western blot were used to determine autophagy in liver cancer cells. After combined treatment with chloroquine (CQ) and emodin, cancer cell survival was analyzed by ATPlite assay and clonogenic assay. Apoptosis was detected by both flow cytometry analysis and Western blot. Results: Autophagy could be induced in liver cancer cells after treatment with emodin. Inhibition of autophagy significantly increased growth-inhibitory effect of emodin on both HepG2 and Huh7 cancer cells. The combination treatment with CQ and emodin promoted remarkable apoptosis in liver cancer cells, evidenced by the increase in the percentage of cells in sub-G1phase and the higher expression lever of cleaved caspase-3. Conclusion: Therapeutically targeting autophagy is capable of enhancing cytotoxicity of emodin in liver cancer cell lines.

Emodin; Autophagy; Liver cancer cells; Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.004

R735.7

A

1007-3639(2017)03-0186-05

2016-09-30

2016-12-10）

甘肅省中醫藥管理局基金項目(GZK-2014-71)。

何科基 E-mail: 13893265154@163.com