毛桃葉片愈傷組織誘導

譚彬+郭水歡+韓亞萍+鄭先波++葉霞?├羆潭?+馮建燦

摘要：分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討了不同植物生長調節劑質量濃度組合對毛桃葉片愈傷組織誘導過程中愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響，并對不同處理誘導產生的愈傷組織進行評價。結果表明適合毛桃組培苗葉片愈傷組織再生的最適培養基為MS+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為88.09%和3；適合毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養基為 MS+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為69.77%和4。2種來源葉片外植體最適培養基中誘導產生的愈傷組織其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量雖有差異，但所產生的愈傷組織均為黃綠色，緊實有突起，具備良好的再生能力。

關鍵詞：毛桃（Prunus persica）；葉片；愈傷組織；誘導；再生

中圖分類號： S662.104+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0037-03

我國是世界第一產桃大國，但桃砧木的利用還處在比較原始的狀態，生產上一般都是直接采用野生桃種子（如毛桃、山桃、甘肅桃等）或生產品種（如青州蜜桃）的種子做砧木[1]。其中野生毛桃（Prunus persica）是我國應用最為廣泛的桃樹砧木，其根系發達、生長健壯，與栽培品種嫁接親和性好[2]，抗根結線蟲能力較強，而抗真菌、耐旱性一般[3-4]。與常規桃育種相比，砧木育種周期更長，更加費時費力[1]?，F代生物技術，尤其是組織培養和轉基因技術的出現，為通過基因工程方法提高毛桃抗性、提高育種效率提供了可能。

高效穩定再生體系是開展桃遺傳轉化工作的基礎，由于缺乏穩定、高效的再生體系，桃基因工程、功能基因鑒定等方面研究與應用受到嚴重制約?；蛐?、外植體類型和狀態、基本培養基、植物生長調節劑、碳源、培養條件等均對桃離體再生有影響。劉航空等以早熟油桃華光和曙光為試材，對影響早熟油桃葉片產生胚性愈傷的多個因素進行研究，結果表明外源激素對誘導桃葉片產生胚性愈傷組織影響顯著[5]。齊賢等以黃水蜜桃為對象，研究了不同植物生長調節劑對其胚培苗莖段愈傷組織形成率的影響，結果表明添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA的MS培養基為最適培養基，其愈傷組織形成率為85%[6]。目前國內外關于桃砧木組織培養方面的研究較少，研究對象多為GF677和 Nemaguard[7-8]；所用外植體主要為莖尖、子葉[9-11]等，而葉片[8，12]報道較少?；诖?，本研究分別以桃砧木類型毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討不同植物生長調節劑質量濃度組合對愈傷組織誘導的影響，為高效穩定再生體系建立和遺傳轉化奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料毛桃幼嫩枝條和自交果實分別于2015年4月和8月采自河南農業大學三區桃資源圃。

1.2方法

1.2.1無菌組培苗的獲得

毛桃幼嫩枝條在晴天10：00左右，取田間新梢裝入潔凈塑料袋帶回室內，去掉葉片并保留部分葉柄；用洗衣粉漂洗20 min，經流水沖洗2 h。然后在無菌條件下，剪取帶有腋芽的莖段（1.5～2.0 cm），用70%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%的HgCl2處理 6 min，再用無菌水沖洗2～3遍，接種于初代培養基，培養2周后統計萌芽率；培養4周后將萌發的芽切下后繼代培養，以獲得的無菌組培苗葉片為外植體進行后續試驗。初代培養所用培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA3 0.5 mg/L+AgNO3 0.5 mg/L培養基，繼代培養是在原培養基中再添加200 mg/L頭孢霉素、蔗糖30 g/L、瓊脂6.8 g/L，PH值5.7，培養條件為溫度（26±2） ℃，相對濕度60%～70%，光照度為1 500～2 000 lx，每日光照14 h（下同）。

1.2.2胚培苗的獲得

毛桃胚培苗的獲得參照齊賢等的方法[6]略作修改。具體操作步驟如下：將采摘的毛桃果實去除果肉，沖洗干凈后將桃核用5%（體積分數）的次氯酸鈉消毒20 min，用錘子砸開桃核取出核仁，在超凈工作臺上用70%酒精浸泡核仁30 s，用無菌水沖洗2～3遍，然后用0.1%（質量濃度）的HgCl2消毒5 min，用無菌水沖洗5次，將滅菌的核仁接種在WPM培養基上，放進4 ℃培養箱內暗培養45 d后轉入光照培養室培養。光照培養14 d和28 d后分別調查萌芽率和成苗率，并以獲得的胚培苗葉片為外植體進行后續試驗。

1.2.3毛桃愈傷組織的誘導

葉片外植體分別取自組培苗和胚培苗，選取生長良好、完全展開的幼嫩葉片，垂直主脈橫切2～3刀，不傷及葉緣，將近軸面向上平鋪于培養基上。不同處理所用基本培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3，不同處理培養基中添加植物生長調節劑種類及濃度如表1所示。每處理接種30個外植體，重復3次。接種后進行暗培養，暗培養4周后轉入光培養，光培養1周后分別調查不同處理愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量，并記錄愈傷組織生長狀態。暗培養溫度為（26±2） ℃，相對濕度 60%～70%。

2結果與分析

[HTK]2.1不同植物生長調節劑對毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將帶有腋芽的毛桃莖段經消毒處理后接種至培養基（圖1-A），培養1周后腋芽開始萌發（圖1-B），培養2周后統計萌芽率為69.02%，繼續培養2周后將萌發的腋芽切下轉移至新鮮培養基進行伸長培養，培養4周后獲得生長旺盛的無菌組培苗（圖1-C）。將獲得的無菌組培苗葉片分別接種至添加不同種類和濃度植物生長調節劑的培養基中，暗培養1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產生愈傷組織，隨著暗培養的時間的延長，產生愈傷組織的葉片數明顯增多，暗培養4周后轉入光下培養1周，5個處理大部分葉片切口處均產生愈傷組織（圖1-D至圖1-H）。此時觀察不同處理愈傷組織顏色和生長狀態（圖1-D至圖1-H，表2），其中處理1誘導產生的愈傷組織為淺綠色，松散，輕微褐化，有光澤（圖1-D）；處理2誘導產生的愈傷組織為白色，較松散，成海綿狀（圖1-E）；處理3誘導產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑（圖1-F）；處理4誘導產生的愈傷組織黃綠色，且有白色，松散，成海綿狀，褐化（圖1-G）；處理5誘導產生的愈傷組織為綠色，有突起，輕微褐化

不同植物生長調節劑種類和濃度對毛桃組培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表2所示。MS培養基中添加1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率最高，為88.09%；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率明顯高于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2），而愈傷組織相對生長量則相反；當TDZ濃度一定時，TDZ與2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量高于TDZ與NAA組合（處理4）；培養基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量最低，分別為6714%和1。綜合分析可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA（處理3）。

[HTK]2.2不同植物生長調節劑對毛桃胚培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將滅菌的毛桃核仁接種在WPM培養基上（圖2-A），4 ℃ 培養箱內暗培養45 d后轉入光照培養室培養，培養14 d和28 d后分別調查萌芽率和成苗率，均為95%。從生長健壯的胚培苗（圖2-B）上取葉片接種到愈傷組織誘導培養基上，暗培養1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產生愈傷組織，隨著暗培養的進行產生愈傷組織的葉片數明顯增多，暗培養4周后轉入光下培養1周，發現5個處理大部分葉片切口處均產生愈傷組織（圖2-C至圖2-G），但不同處理產生的愈傷組織顏色和狀態存在一定差異（圖2 C-G，表3）。其中處理1誘導產生的愈傷組織為黃綠色，略帶白色，松散（圖2-C）；處理2誘導產生的愈傷組織為黃色，松散，成海綿狀（圖2-D）；處理3誘導產生的愈傷組織為黃白色，松散，輕微褐化（圖2-E）；處理4誘導產生的愈傷組織黃綠色，緊實有突起（圖2-F）；處理5誘導產生的愈傷組織為黃白色，有突起（圖2-G）。此外，不同處理中愈傷組織主要產生的部位也有差異（圖2-C至圖2-G）， 除處理5誘導產生的愈傷組織主要

植物生長調節劑種類和濃度對毛桃胚培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表3所示。當 1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L KT（處理2）共同使用時，愈傷組織形成率最高，為80.68%，但此處理產生的愈傷組織松散、成海綿狀，此種狀態愈傷組織不具備再生能力；而當培養基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率最低（66.02%），這一結果與毛桃組培苗葉片誘導產生愈傷組織結果一致（67.14%，最低），但該處理誘導產生的愈傷組織沒有發生褐化；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率低于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2）；當TDZ濃度一定時，TDZ和2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率與TDZ和NAA組合差異不顯著（處理4），此結果與毛桃組培苗葉片誘導產生愈傷組織結果相反，但處理4的愈傷組織相對生長量高于處理3，且處理4產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，此種狀態的愈傷組織具備良好的再生能力。綜合愈傷組織顏色和狀態、愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA（處理4）。

3結論與討論

外源植物生長調節劑對桃葉片的愈傷組織誘導影響顯著，其中TDZ和BA被認為是誘導效果比較好的細胞分裂素，而生長素常用的有2，4-D和NAA。叢芳等以桃栽培品種曙光、金童5號和甜桃王試管苗[JP2]葉片為外植體，研究了植物生長調節劑種類及濃度對葉片再生的影響，結果表明3種基因型試管苗葉片在LP+0.4 mg/L

TDZ培養基中生長較好，且愈傷組織形成率均最高，分別達到72.2%、78.8%和71.3%[13]；張永慶等以奉化玉露桃不同外植體進行離體培養試驗，其中以幼葉為外植體得到的愈傷組織誘導率為70%，且得到的愈傷組織為深綠色，硬實，粉狀，多次繼代培養后發褐衰老[14]；而本研究中以毛桃組培苗葉片為外植體研究不同植物生長調節物質對愈傷組織誘導的影響，結果表明愈傷組織誘導的最適培養基為 MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織形成率為88.09%，明顯高于叢芳等的研究結果[11-12]，且誘導產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑。

此外，同一基因型相同外植體因其來源不同其愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態均有差異?，F有關于桃葉片離體培養的報道中所用葉片主要取自田間枝條消毒處理后培養獲得的無菌苗[8，12，15]，而用胚培苗葉片的尚未見報道。本研究分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體進行愈傷組織誘導，2種來源葉片在不同培養基中均成功誘導產生愈傷組織，不同處理中愈傷組織形成率最高分別可達88.09%和88.68%；但結合愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態綜合分析發現，2種來源的葉片愈傷組織誘導的最適培養基卻不相同，其中組培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養基中添加的是2，4-D和 6-BA，而胚培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養基中添加的是TDZ和NAA，這種差異的產生可能與2種來源葉片本身的生理狀態有關。

桃樹通過愈傷組織和體細胞再生系統途徑再生的研究進展相當緩慢，而植物遺傳轉化的眾多研究已經證明通過愈傷組織再生系統轉化率較高，因此，建立一個高效且適宜于桃遺傳轉化的通過愈傷組織或胚狀體再生途徑的再生系統已成為開展轉基因工作的關鍵環節[16]。本研究初步獲得了大量生長狀態良好、穩定一致的毛桃愈傷組織，為后續通過愈傷組織途徑建立再生體系和通過基因工程方法進行毛桃種質的改良奠定基礎。

參考文獻：

[1]王志強，牛良，劉淑娥，等. 世界桃砧木育種現狀與展望[C]. 中國園藝學會桃分會成立大會暨學術研討會論文集，2007.

[HT8.]

[2]浙江農業大學.果樹育種學[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1980：270.

[3]葉航. 4種桃砧木對南方根結線蟲的抗性研究[D]. 北京：中國農業大學，2006.

[4]曹艷平. 幾種桃樹砧木的抗旱和耐澇性研究[D]. 北京：中國農業大學，2007.

[5]劉航空，韓明玉，禹婷，等. 影響油桃葉片產生胚性愈傷組織的因素[J]. 果樹學報，2006，23（3）：370-374.

[6]齊賢，譚彬，鄭先波，等. ‘黃水蜜桃實生苗莖段再生體系的建立[J]. 果樹學報，2015，32（5）：866-871.

[7]Peérez-Jimeénez M，Carrillo-Navarro A，C-Terrer J. Regeneration of peach [Prunus persica （L.） Batsch] cultivars and Prunus persica×Prunus dulcis rootstocks via organogenesis[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2012，108：55-62.

[8][JP2]Zhou H C，Li M，Zhao X，et al. Plant regeneration from in vitro leaves of the peach rootstock ‘Nemaguard（Prunus persica × P. davidiana）[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，101：79-87.[JP]

[9]張衡濤，李靖，宋尚偉，等. 桃矮化砧木的組織培養及植株再生[J]. 河南農業大學學報，2004，38（1）：77-81.[ZK）]

[10][ZK（#]馬常念，張慧琴，肖金平，等. 三種桃砧木莖尖培養技術的研究[J]. 浙江農業學報，2013，25（3）：503-508.[HJ1.88mm]

[11]Pooler M.R.，Scorza R. Regeneration of peach[Prunus persica （L.） Batsch]rootstock cultivar from cotyledons of mature stored seed[J]. HortScience，1995，30（2）：355-356.

[12]San B S，Li Z G，Hu J，et al. Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaf explants of peach rootstock Guardian is significantly enhanced by silver thiosulfate[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120：757-765.

[13]叢芳，韓明玉，趙彩平，等. 桃葉片再生不定芽的研究[J]. 果樹學報，2009，26（5）：614-618.

[14]張永慶，陳大明，金勇豐，等. 桃離體組織分化再生植株的研究[J]. 園藝學報，2001，28（4）：342-343.

[15]Gentile A，Monticelli S，Damiano C，et al. Adventitious shoot regeneration in peach[Prunus persica （L.） Batsch][J]. Plant Cell Rep，2002，20：1011-1016.

[16]吳延軍，徐昌杰，張上隆. 桃組織培養和遺傳轉化研究現狀及展望[J]. 果樹學報，2002，19（2）：123-127.

[FQ）]

譚彬 郭水歡 韓亞萍 鄭先波 葉霞?├羆潭? 馮建燦

摘要：分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討了不同植物生長調節劑質量濃度組合對毛桃葉片愈傷組織誘導過程中愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響，并對不同處理誘導產生的愈傷組織進行評價。結果表明適合毛桃組培苗葉片愈傷組織再生的最適培養基為MS+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為88.09%和3；適合毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養基為 MS+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為69.77%和4。2種來源葉片外植體最適培養基中誘導產生的愈傷組織其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量雖有差異，但所產生的愈傷組織均為黃綠色，緊實有突起，具備良好的再生能力。

關鍵詞：毛桃（Prunus persica）；葉片；愈傷組織；誘導；再生

中圖分類號： S662.104+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0037-03

我國是世界第一產桃大國，但桃砧木的利用還處在比較原始的狀態，生產上一般都是直接采用野生桃種子（如毛桃、山桃、甘肅桃等）或生產品種（如青州蜜桃）的種子做砧木[1]。其中野生毛桃（Prunus persica）是我國應用最為廣泛的桃樹砧木，其根系發達、生長健壯，與栽培品種嫁接親和性好[2]，抗根結線蟲能力較強，而抗真菌、耐旱性一般[3-4]。與常規桃育種相比，砧木育種周期更長，更加費時費力[1]?，F代生物技術，尤其是組織培養和轉基因技術的出現，為通過基因工程方法提高毛桃抗性、提高育種效率提供了可能。

高效穩定再生體系是開展桃遺傳轉化工作的基礎，由于缺乏穩定、高效的再生體系，桃基因工程、功能基因鑒定等方面研究與應用受到嚴重制約?；蛐?、外植體類型和狀態、基本培養基、植物生長調節劑、碳源、培養條件等均對桃離體再生有影響。劉航空等以早熟油桃華光和曙光為試材，對影響早熟油桃葉片產生胚性愈傷的多個因素進行研究，結果表明外源激素對誘導桃葉片產生胚性愈傷組織影響顯著[5]。齊賢等以黃水蜜桃為對象，研究了不同植物生長調節劑對其胚培苗莖段愈傷組織形成率的影響，結果表明添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA的MS培養基為最適培養基，其愈傷組織形成率為85%[6]。目前國內外關于桃砧木組織培養方面的研究較少，研究對象多為GF677和 Nemaguard[7-8]；所用外植體主要為莖尖、子葉[9-11]等，而葉片[8，12]報道較少?；诖?，本研究分別以桃砧木類型毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討不同植物生長調節劑質量濃度組合對愈傷組織誘導的影響，為高效穩定再生體系建立和遺傳轉化奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料毛桃幼嫩枝條和自交果實分別于2015年4月和8月采自河南農業大學三區桃資源圃。

1.2方法

1.2.1無菌組培苗的獲得

毛桃幼嫩枝條在晴天10：00左右，取田間新梢裝入潔凈塑料袋帶回室內，去掉葉片并保留部分葉柄；用洗衣粉漂洗20 min，經流水沖洗2 h。然后在無菌條件下，剪取帶有腋芽的莖段（1.5～2.0 cm），用70%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%的HgCl2處理 6 min，再用無菌水沖洗2～3遍，接種于初代培養基，培養2周后統計萌芽率；培養4周后將萌發的芽切下后繼代培養，以獲得的無菌組培苗葉片為外植體進行后續試驗。初代培養所用培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA3 0.5 mg/L+AgNO3 0.5 mg/L培養基，繼代培養是在原培養基中再添加200 mg/L頭孢霉素、蔗糖30 g/L、瓊脂6.8 g/L，PH值5.7，培養條件為溫度（26±2） ℃，相對濕度60%～70%，光照度為1 500～2 000 lx，每日光照14 h（下同）。

1.2.2胚培苗的獲得

毛桃胚培苗的獲得參照齊賢等的方法[6]略作修改。具體操作步驟如下：將采摘的毛桃果實去除果肉，沖洗干凈后將桃核用5%（體積分數）的次氯酸鈉消毒20 min，用錘子砸開桃核取出核仁，在超凈工作臺上用70%酒精浸泡核仁30 s，用無菌水沖洗2～3遍，然后用0.1%（質量濃度）的HgCl2消毒5 min，用無菌水沖洗5次，將滅菌的核仁接種在WPM培養基上，放進4 ℃培養箱內暗培養45 d后轉入光照培養室培養。光照培養14 d和28 d后分別調查萌芽率和成苗率，并以獲得的胚培苗葉片為外植體進行后續試驗。

1.2.3毛桃愈傷組織的誘導

葉片外植體分別取自組培苗和胚培苗，選取生長良好、完全展開的幼嫩葉片，垂直主脈橫切2～3刀，不傷及葉緣，將近軸面向上平鋪于培養基上。不同處理所用基本培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3，不同處理培養基中添加植物生長調節劑種類及濃度如表1所示。每處理接種30個外植體，重復3次。接種后進行暗培養，暗培養4周后轉入光培養，光培養1周后分別調查不同處理愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量，并記錄愈傷組織生長狀態。暗培養溫度為（26±2） ℃，相對濕度 60%～70%。

2結果與分析

[HTK]2.1不同植物生長調節劑對毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將帶有腋芽的毛桃莖段經消毒處理后接種至培養基（圖1-A），培養1周后腋芽開始萌發（圖1-B），培養2周后統計萌芽率為69.02%，繼續培養2周后將萌發的腋芽切下轉移至新鮮培養基進行伸長培養，培養4周后獲得生長旺盛的無菌組培苗（圖1-C）。將獲得的無菌組培苗葉片分別接種至添加不同種類和濃度植物生長調節劑的培養基中，暗培養1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產生愈傷組織，隨著暗培養的時間的延長，產生愈傷組織的葉片數明顯增多，暗培養4周后轉入光下培養1周，5個處理大部分葉片切口處均產生愈傷組織（圖1-D至圖1-H）。此時觀察不同處理愈傷組織顏色和生長狀態（圖1-D至圖1-H，表2），其中處理1誘導產生的愈傷組織為淺綠色，松散，輕微褐化，有光澤（圖1-D）；處理2誘導產生的愈傷組織為白色，較松散，成海綿狀（圖1-E）；處理3誘導產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑（圖1-F）；處理4誘導產生的愈傷組織黃綠色，且有白色，松散，成海綿狀，褐化（圖1-G）；處理5誘導產生的愈傷組織為綠色，有突起，輕微褐化

不同植物生長調節劑種類和濃度對毛桃組培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表2所示。MS培養基中添加1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率最高，為88.09%；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率明顯高于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2），而愈傷組織相對生長量則相反；當TDZ濃度一定時，TDZ與2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量高于TDZ與NAA組合（處理4）；培養基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量最低，分別為6714%和1。綜合分析可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA（處理3）。

[HTK]2.2不同植物生長調節劑對毛桃胚培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將滅菌的毛桃核仁接種在WPM培養基上（圖2-A），4 ℃ 培養箱內暗培養45 d后轉入光照培養室培養，培養14 d和28 d后分別調查萌芽率和成苗率，均為95%。從生長健壯的胚培苗（圖2-B）上取葉片接種到愈傷組織誘導培養基上，暗培養1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產生愈傷組織，隨著暗培養的進行產生愈傷組織的葉片數明顯增多，暗培養4周后轉入光下培養1周，發現5個處理大部分葉片切口處均產生愈傷組織（圖2-C至圖2-G），但不同處理產生的愈傷組織顏色和狀態存在一定差異（圖2 C-G，表3）。其中處理1誘導產生的愈傷組織為黃綠色，略帶白色，松散（圖2-C）；處理2誘導產生的愈傷組織為黃色，松散，成海綿狀（圖2-D）；處理3誘導產生的愈傷組織為黃白色，松散，輕微褐化（圖2-E）；處理4誘導產生的愈傷組織黃綠色，緊實有突起（圖2-F）；處理5誘導產生的愈傷組織為黃白色，有突起（圖2-G）。此外，不同處理中愈傷組織主要產生的部位也有差異（圖2-C至圖2-G）， 除處理5誘導產生的愈傷組織主要

植物生長調節劑種類和濃度對毛桃胚培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表3所示。當 1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L KT（處理2）共同使用時，愈傷組織形成率最高，為80.68%，但此處理產生的愈傷組織松散、成海綿狀，此種狀態愈傷組織不具備再生能力；而當培養基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率最低（66.02%），這一結果與毛桃組培苗葉片誘導產生愈傷組織結果一致（67.14%，最低），但該處理誘導產生的愈傷組織沒有發生褐化；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率低于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2）；當TDZ濃度一定時，TDZ和2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率與TDZ和NAA組合差異不顯著（處理4），此結果與毛桃組培苗葉片誘導產生愈傷組織結果相反，但處理4的愈傷組織相對生長量高于處理3，且處理4產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，此種狀態的愈傷組織具備良好的再生能力。綜合愈傷組織顏色和狀態、愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA（處理4）。

3結論與討論

外源植物生長調節劑對桃葉片的愈傷組織誘導影響顯著，其中TDZ和BA被認為是誘導效果比較好的細胞分裂素，而生長素常用的有2，4-D和NAA。叢芳等以桃栽培品種曙光、金童5號和甜桃王試管苗[JP2]葉片為外植體，研究了植物生長調節劑種類及濃度對葉片再生的影響，結果表明3種基因型試管苗葉片在LP+0.4 mg/L

TDZ培養基中生長較好，且愈傷組織形成率均最高，分別達到72.2%、78.8%和71.3%[13]；張永慶等以奉化玉露桃不同外植體進行離體培養試驗，其中以幼葉為外植體得到的愈傷組織誘導率為70%，且得到的愈傷組織為深綠色，硬實，粉狀，多次繼代培養后發褐衰老[14]；而本研究中以毛桃組培苗葉片為外植體研究不同植物生長調節物質對愈傷組織誘導的影響，結果表明愈傷組織誘導的最適培養基為 MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織形成率為88.09%，明顯高于叢芳等的研究結果[11-12]，且誘導產生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑。

此外，同一基因型相同外植體因其來源不同其愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態均有差異?，F有關于桃葉片離體培養的報道中所用葉片主要取自田間枝條消毒處理后培養獲得的無菌苗[8，12，15]，而用胚培苗葉片的尚未見報道。本研究分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體進行愈傷組織誘導，2種來源葉片在不同培養基中均成功誘導產生愈傷組織，不同處理中愈傷組織形成率最高分別可達88.09%和88.68%；但結合愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態綜合分析發現，2種來源的葉片愈傷組織誘導的最適培養基卻不相同，其中組培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養基中添加的是2，4-D和 6-BA，而胚培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養基中添加的是TDZ和NAA，這種差異的產生可能與2種來源葉片本身的生理狀態有關。

桃樹通過愈傷組織和體細胞再生系統途徑再生的研究進展相當緩慢，而植物遺傳轉化的眾多研究已經證明通過愈傷組織再生系統轉化率較高，因此，建立一個高效且適宜于桃遺傳轉化的通過愈傷組織或胚狀體再生途徑的再生系統已成為開展轉基因工作的關鍵環節[16]。本研究初步獲得了大量生長狀態良好、穩定一致的毛桃愈傷組織，為后續通過愈傷組織途徑建立再生體系和通過基因工程方法進行毛桃種質的改良奠定基礎。

參考文獻：

[1]王志強，牛良，劉淑娥，等. 世界桃砧木育種現狀與展望[C]. 中國園藝學會桃分會成立大會暨學術研討會論文集，2007.

[HT8.]

[2]浙江農業大學.果樹育種學[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1980：270.

[3]葉航. 4種桃砧木對南方根結線蟲的抗性研究[D]. 北京：中國農業大學，2006.

[4]曹艷平. 幾種桃樹砧木的抗旱和耐澇性研究[D]. 北京：中國農業大學，2007.

[5]劉航空，韓明玉，禹婷，等. 影響油桃葉片產生胚性愈傷組織的因素[J]. 果樹學報，2006，23（3）：370-374.

[6]齊賢，譚彬，鄭先波，等. ‘黃水蜜桃實生苗莖段再生體系的建立[J]. 果樹學報，2015，32（5）：866-871.

[7]Peérez-Jimeénez M，Carrillo-Navarro A，C-Terrer J. Regeneration of peach [Prunus persica （L.） Batsch] cultivars and Prunus persica×Prunus dulcis rootstocks via organogenesis[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2012，108：55-62.

[8][JP2]Zhou H C，Li M，Zhao X，et al. Plant regeneration from in vitro leaves of the peach rootstock ‘Nemaguard（Prunus persica × P. davidiana）[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，101：79-87.[JP]

[9]張衡濤，李靖，宋尚偉，等. 桃矮化砧木的組織培養及植株再生[J]. 河南農業大學學報，2004，38（1）：77-81.[ZK）]

[10][ZK（#]馬常念，張慧琴，肖金平，等. 三種桃砧木莖尖培養技術的研究[J]. 浙江農業學報，2013，25（3）：503-508.[HJ1.88mm]

[11]Pooler M.R.，Scorza R. Regeneration of peach[Prunus persica （L.） Batsch]rootstock cultivar from cotyledons of mature stored seed[J]. HortScience，1995，30（2）：355-356.

[12]San B S，Li Z G，Hu J，et al. Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaf explants of peach rootstock Guardian is significantly enhanced by silver thiosulfate[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120：757-765.

[13]叢芳，韓明玉，趙彩平，等. 桃葉片再生不定芽的研究[J]. 果樹學報，2009，26（5）：614-618.

[14]張永慶，陳大明，金勇豐，等. 桃離體組織分化再生植株的研究[J]. 園藝學報，2001，28（4）：342-343.

[15]Gentile A，Monticelli S，Damiano C，et al. Adventitious shoot regeneration in peach[Prunus persica （L.） Batsch][J]. Plant Cell Rep，2002，20：1011-1016.

[16]吳延軍，徐昌杰，張上隆. 桃組織培養和遺傳轉化研究現狀及展望[J]. 果樹學報，2002，19（2）：123-127.

[FQ）]