食品中羅丹明B的高效液相色譜串聯質譜法檢測

葉佳明，汪慶旗，應寒松，葉磊海，王慶齡

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

食品中羅丹明B的高效液相色譜串聯質譜法檢測

葉佳明1，2，汪慶旗1，2，應寒松1，2，葉磊海1，2，王慶齡1，2

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

建立了使用高效液相色譜串聯質譜法檢測食品中羅丹明B含量的分析方法。食用油樣品經70%甲醇水溶液提取后，直接可用于進樣分析，固體樣品以70%甲醇溶液提取、MCX固相萃取柱凈化，經色譜柱分離后，以0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脫，經ESI+模式、多反應模式（MRM）進行檢測。結果表明，羅丹明B在1.0~100.0 ng/mL質量濃度范圍內呈良好的線性關系，空白樣品加標的回收率在90.3%~96.8%，相對標準偏差（RSD）均小于5%，檢出限為0.5 μg/kg，具有快速、準確、靈敏度高等優點，適用于食品中羅丹明B的定性和定量分析。

羅丹明B；固相萃??；液相色譜串聯質譜

羅丹明B又稱為堿性玫瑰精，是一種鮮桃紅色的三苯甲烷類堿性人工合成染料，具有持久鮮艷的熒光特性和良好的脂溶性[1]，因其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特性[2]，我國和歐盟等都不允許在食品中添加，但仍有部分不法商企使用羅丹明B對辣椒等調味料進行染色。目前，食品中羅丹明B的檢測方法主要使用高效液相色譜-熒光法和高效液相色譜-質譜法[3-4]。這2種檢測方法均能滿足對低殘留羅丹明B的檢測，主要存在的問題集中在樣品的提取凈化過程，作為檢測標準被實驗室廣泛使用的僅有SN/T2430—2010進出口食品中羅丹明B的檢測方法。該方法采用凝膠凈化系統GPC進行純化，采用液相色譜熒光檢測器或質譜檢測器進行分析，使用GPC凈化存在有機溶劑使用量大、操作繁瑣、難以批量操作等問題。另一種常用的凈化手段是使用中性氧化鋁柱凈化[5]，但中性氧化鋁柱法凈化存在準備周期長、樣品回收率不穩定等問題。喬勇升等人[6]對食用油中的羅丹明B采用丙酮提取，經MCX陽離子固相萃取柱凈化后采用超高效液相色譜-串聯質譜檢測，但丙酮試劑應用范圍小，不適用其他類食品中羅丹明B的檢測。試驗以70%甲醇水為提取液，食用油等常規樣品簡單處理即可直接檢測，復雜基質樣品使用固相萃取柱富集凈化，以高效液相色譜串聯質譜法進行定性、定量檢測分析。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，Agilent 6460型三重四級桿串聯質譜儀，AR2140型電子分析天平，IKA VORTEX GENIU 3型渦旋混合器，TGL-16G型臺式離心機，KS-300EI型超聲波清洗器，氮吹儀。

甲醇（色譜級），乙腈（色譜級），丙酮（色譜級），正己烷（色譜級），羅丹明B標準品（Sigma公司產品，純度95%），Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm），OasisHLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取

（1）丙酮提取。稱取2.0 g食用油樣品于50 mL離心管中，加入10 mL丙酮渦旋溶解后，經MCX小柱凈化，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，再依次用3 mL丙酮，3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相復溶，過0.22 μm濾膜后，待測。

（2）乙腈水提取。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液渦旋3 min，超聲提取20 min。以轉速4 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜后，待測。

（3） 乙腈水-正己烷提取。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液渦旋3 min，再加入5 mL正己烷渦旋振蕩，超聲提取20 min。以轉速4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷層，下層液體過0.22 μm濾膜后，待測。

1.2.2 凈化

取2 mL 70%乙腈水提取液于40℃下氮氣吹干，去除有機相后過HLB小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，用3 mL水淋洗，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相復溶，過0.22 μm濾膜后，待測。

取2 mL 70%乙腈水提取液過MCX小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，依次用3 mL0.1 mol/L鹽酸水溶液，3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相復溶，過0.22 μm濾膜后，待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18，RRHD 1.8 μm，2.1 mm× 100 mm；流動相：0.1%甲醇水溶液和乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：2 μL。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 質譜條件

電噴霧ESI離子源；正離子掃描模式；多反應檢測模式（MRM）。

質譜離子源參數見表2，MRM質譜參數見表3。

表2 質譜離子源參數

表3 MRM質譜參數

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

羅丹明B具有較強的極性，易溶于水、甲醇和乙腈，微溶于丙酮。對于水溶性樣品溶解后即為提取完全，但含油脂樣品中需要加入一定比例的甲醇或者乙腈才能提高提取率，通過試驗比較，70%甲醇水溶液提取效果理想且回收率穩定。試驗采用70%甲醇水作為提取溶液，并比較了文獻[6]報道中丙酮提取效果。正己烷能有效去除脂肪，加入正己烷混合提取后，經離心處理，能充分去除提取液中的少量油脂。試驗考察了加入正己烷后對羅丹明B提取效果的影響。

不同溶劑提取回收率見表4。

表4 不同溶劑提取回收率

針對辣椒油、花椒油等食用油樣品分別用丙酮、70%乙腈水溶液，70%乙腈水-正己烷溶液提取，均有較好的提取效果。由表4可知，3種提取液的平均加標回收率在89.2%~98.6%，丙酮提取液與70%乙腈水提取液提取效果基本相似，70%乙腈水-正己烷提取液平均回收率在90%左右，略低于其他2種提取液，這可能是由于少量羅丹明B殘留在正己烷溶劑中。加入正己烷后雖能去除提取液中的油脂，但也降低了羅丹明B的提取率，綜合考慮不使用正己烷凈化處理。為考察實際樣品的提取效果，選取3個陽性辣椒油樣品，分別采用丙酮、70%甲醇水、70%甲醇水-正己烷溶液提取，3種提取液中70%甲醇水提取液測定結果最高，丙酮其次，70%甲醇水-正己烷溶液提取效果略差，只有70%甲醇水提取率的90%左右，與加標試驗結果一致。針對食用油樣品以70%甲醇水溶液提取即可直接分析檢測，使用丙酮提取還需要過柱凈化，綜合分析采用70%甲醇水作為提取溶液。

辣椒油中不同溶劑提取羅丹明B測定值見圖1。

圖1 辣椒油中不同溶劑提取羅丹明B測定值

2.2 固相萃取柱凈化

食用油樣品通過70%甲醇水提取，即可進行測定分析，對于其他復雜基質的樣品，僅采用70%甲醇提取后，提取液雜質含量多、基質效應大，會影響測定的準確性；采用固相萃取柱凈化后，能大幅降低基質效應的影響，并能提高儀器的靈敏度。根據羅丹明B結構中具有氨基、羧基和苯環，分別選取陽離子交換固相萃取柱（Oasis MCX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）進行凈化效果考察。按試驗方法進行樣品凈化，結果顯示，以Oasis MCX柱凈化回收率為95.2%±2.0%，以Oasis HLB柱凈化回收率為89.4%±3.2%，二者均能滿足羅丹明B的分析檢測要求。二者相比較，Oasis MCX柱回收率更高、操作更簡單，提取液不需要去除有機溶劑即可直接過柱凈化，因此選用Oasis MCX柱作為凈化萃取柱。

2.3 標準曲線和檢出限

分別配置標準溶液，質量濃度分別為1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 ng/mL進行分析，以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標、羅丹明B質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

羅丹明B的濃度在1.0~100.0 ng/mL范圍內呈線性分布，其線性回歸方程為Y=9 035.1X+855.8，相關系數為0.999 8。采用空白基質添加羅丹明B標準品的方法，以3倍信噪比計算羅丹明B的檢出限為0.5 μg/kg。

羅丹明B標準品的液質總離子流圖及MRM圖（質量濃度為50 ng/mL）見圖2。

2.4 方法精密度和回收率

選取辣椒油、黃豆醬、花生樣品，添加不同含量的羅丹明B標準品，按試驗方法進行處理，平行測定6份。

精密度和回收率（n=6）見表5。

由表5可知，樣品的平均加標回收率在90.3%~ 96.8%，相對標準偏差（RSD）均小于5%。結果表明，此方法具有良好的準確性和可靠性。

圖2 羅丹明B液質總離子流圖及MRM圖

表5 精密度和回收率（n=6）

3 結論

試驗研究了食品中羅丹明B高效液相串聯質譜檢測方法，比較了不同溶劑的提取效果，通過MCX固相萃取柱凈化后，降低了樣品的基質效應，去除了大部分雜質，空白樣品加標回收和重復性良好。該法具有快速、準確、靈敏度高等優點，適用于食品中羅丹明B的定性和定量分析，也為其他類似工業染料的檢測方法提供參考。

[1]咸瑞卿，高文超，王小兵，等.調味品中羅丹明B的HPLCFLD-DAD測定方法研究 [J].中國調味品，2013（38）：109-111.

[2]王傳現，韓麗，方曉明，等.食品中羅丹明B的高效液相色譜熒光檢測 [J].分析儀器，2008（1）：27-30.

[3]林清荷，陳鑫，吳忠興.辣椒粉中羅丹明B液相色譜檢測方法的研究 [J].農產品加工（學刊），2012（11）：157-159.

[4]朱曉軍，顏春榮，董璨，等.固相萃取-液質聯用同時檢測豆制品中4種紅黃色系工業染料 [J].2012（6）：190-194.

[5]薛昆鵬，金小青，余沖，等.固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定辣椒制品中的羅丹明B[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（6）：2 375-2 380.

[6]喬勇升，韓芷玲，劉媛，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定食用調味油中的羅丹明B[J].理化檢驗-化學分冊，2013，49（7）：844-847.

Determination of Rhodamine B in Food by High Performance Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectromrtry

YE Jiaming1，2，WANG Qingqi1，2，YING Hansong1，2，YE Leihai1，2，WANG Qingling1，2
（1.Zhejiang Gongzheng Testing Center Co.，Ltd.，Hangzhou，Zhejiang 310009，China；2.Zhejiang Zanyu Technology Group Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310009，China）

An analysis method is established for detecting the content of Rhodamine B in food using performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry.Sample of edible flavoring oil is extracted with 70%methanol water solution，which can be directly used for analysis.Solid sample is extracted with 70%methanol，the extracting solution is taken for purification by MCX cation solid phase extraction column，and then separated by C18column，using acetonitrile and 0.1% formic acid solution for gradient elution，detected by positive ESI+and multi-reactions monitoring modes.The result shows that the linearity of Rhodamine B is better in the range of 1.0~100.0 ng/mL.Test for recovery are made at different concentration levels of Rhodamine B standard，giving values of recovery in the range of 90.3%~96.8%，with RSD less than 5%.The detection limit of Rhodamine B is 0.5 μg/kg.The method has the characteristics of low detection limit and high sensitivity，so it is suitable for qualitative and quantitative analysis of Rhodamine B in food.

Rhodamine B；solid phase extraction；performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry

O658

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.042

1671-9646（2017）02b-0052-03

2017-01-06

葉佳明（1987— ），男，碩士，助理工程師，研究方向為食品檢測。