養血行血方抗大鼠實驗性外傷性視神經損傷的形態學觀察

肖家翔，文婷，姚瑩

養血行血方抗大鼠實驗性外傷性視神經損傷的形態學觀察

肖家翔，文婷，姚瑩

目的觀察養血行血方對實驗性外傷性視神經損傷的保護作用。方法將實驗SD大鼠60只隨機抽取15只為空白對照組，其余45只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組，每組15只?？瞻讓φ战M及模型對照組造模24小時后，生理鹽水組及中藥治療組（養血行血方）用藥4周后取左眼觀察視網膜視神經的形態變化。結果大鼠造模后大量RGC腫脹變形，胞核腫脹明顯，神經纖維層顯著水腫；生理鹽水組大量RGC胞體變形，呈空泡樣變性脫落，數量顯著減少，核皺縮，神經纖維層顯著變??；而中藥治療組只有少量RGC輕度腫脹，少量變性，數量略減少，胞核可見，神經纖維層輕度變薄。結論養血行血方能抗RGC損傷，降低其凋亡，促進視神經纖維的修復而保護視神經。

養血行血方；視神經/外傷；疾病模型；動物

視神經萎縮（optic atrophy，OA）是視網膜神經節細胞（RGC）及其軸突、視神經纖維由于各種原因受損害的結果，是眼科主要致盲性眼病之一[1-2]。本病以外傷性、炎癥性居多[3]。外傷性視神經損傷導致的視神經萎縮的研究既往主要集中在解除視神經受壓方面，而“神經保護”未得到足夠的重視。臨床上相當多的患者在視神經解壓后已存在視功能的損害，表明在視神經受壓時需及時對視神經進行保護性治療，故本研究采用臨床治療視神經萎縮行之有效，以養血行血為法組方制成的雙芍護睛散用于實驗性外傷性視神經損傷的治療，通過對視網膜視神經的形態學觀察，以驗證養血行血方抗視神經損傷的作用，為有效治療視神經萎縮提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：選用健康3月齡SD大鼠60只，雌雄不限，體重200-250 g，由貴州醫科大學動物實驗中心提供（合格證號：SCXK（黔）2013-017）。購進大鼠經手持裂隙燈檢查雙眼角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔對光反射靈敏，晶狀體無混濁者納入實驗。將60只大鼠抽取15只為空白對照組，其余45只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組，每組15只。

藥物及儀器：雙芍護睛散（白芍、赤芍、茺蔚子、桑葚、澤蘭、牛膝、雞血藤、川芎等），按現代中藥制劑工藝制成散劑，由貴陽中醫學院中藥制劑室制備。儀器：瑞典產LKBⅢ型超薄切片機；日本產JEM-1200EX透射電鏡。

1.2 方法

參照李云琴[4]的方法進行造模：將需造模的45只大鼠于造模前3 d用0.25%氯霉素滴眼液滴眼，每日3次。造模時以3.5%水合氯醛右下腹腔注射麻醉，并以1%鹽酸丙美卡因對大鼠左眼進行表面麻醉。麻醉后，將大鼠固定于動物手術臺上，沿左眼顳側角膜緣將球結膜環形剪開，分離球結膜和鞏膜，分離時避開外直肌，然后繼續向后分離，打開肌錐后將視神經暴露出來，用視神經鉗夾器夾于球后視神經2 mm處，鉗夾力相等，30 s后松開鉗夾器，用8-0尼龍線縫合球結膜，造模完成后以慶大霉素做球結膜下注射，以0.3%妥布霉素眼膏涂于結膜囊內，然后將大鼠保溫至蘇醒。觀察造模眼的瞳孔情況，以瞳孔直接對光反射消失，間接對光反射存在者作為造模成功的實驗動物納入實驗。

給藥方法：中藥治療組及生理鹽水組造模成功24 h后開始每日給藥，劑量參照徐叔云[5]關于人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表擬定，治療組以雙芍護睛散混懸液（每100 ml含散劑30 g）灌胃，劑量為5 ml/Kg·d，2次/d；生理鹽水組以等劑量生理鹽水灌胃，2次/d。2周為1個療程，停藥2 d后繼續第2個療程，共2個療程。

標本制作及觀察：空白對照組及模型對照組在造模成功24 h后；中藥治療組以及生理鹽水組給藥2個療程后采用完全隨機法隨機抽取各組中的10只大鼠以10%水合氯醛過量腹腔注射處死，取左眼視網膜作光鏡觀察，重點觀察視網膜神經節細胞及神經纖維層的組織結構。各組剩余5只大鼠同法處死后取左眼視網膜作透射電鏡觀察，主要觀察視網膜神經節細胞的超微結構。

光鏡標本制作：摘取左眼眼球，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）內，4℃固定24 h，去除眼前節，梯度酒精脫水和二甲苯透明后，常規石蠟包埋。將包埋好的眼球標本以平行于視盤矢狀位且以其為平面的視網膜進行連續切片，厚約5 μm，置于預先用多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃溫箱烤片過夜，HE染色。

電鏡標本制作：摘取左眼眼球，在冰上沿角膜緣剪開眼球后，去除晶狀體、玻璃體，翻轉眼球套在臺柱上，用生理鹽水由切口邊緣向中心沖洗，視網膜即可完整脫落懸在視盤上，用眼科顯微鑷夾取視網膜，取包含視盤的一段約2 mm×2 mm的全層視網膜，立即放于2.5%的戊二醛溶液中固定1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗2 h，用1%鋨酸固定2 h，系列乙醇脫水，Epon環氧樹脂812包埋，聚合35℃、40℃、55℃各12 h，半薄切片（1 μm）光學定位，以超薄切片機切片（70 nm），醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色。

2 結果

2.1 光鏡下各組大鼠視網膜的組織結構

光鏡下空白對照組視網膜各層結構形態及排列分布正常，界限清楚。RGC排列整齊，胞漿均質豐富，神經纖維層結構清晰（圖1A）。模型對照組視網膜組織結構可見，大量RGC腫脹，排列不規則，神經纖維層顯著水腫（圖1B）。生理鹽水組視網膜組織結構輕度異常，大量RGC明顯腫脹、空泡樣變性、脫落，排列不規則，數量顯著減少，神經纖維層顯著變?。▓D1C）。中藥治療組視網膜組織結構基本正常，可見少量RGC輕度腫脹，數量略減少，神經纖維層輕度變?。▓D1D）。

2.2 電鏡下各組大鼠視網膜神經節細胞的超微結構

電鏡下空白對照組RGC胞體呈卵圓形，見較長的突起，輪廓清晰，核仁明顯，染色質均，核膜清晰，胞漿均勻，可見散在粗面內質網，線粒體豐富（圖2A）。模型對照組RGC胞體變形，細胞核腫脹明顯，核周間隙增大，線粒體腫脹（圖2B）。生理鹽水組RGC胞體變形，核皺縮，染色質邊聚，線粒體空泡化，微絲數量減少（圖2C）。中藥治療組可見少量RGC變性，細胞核可見，細胞染色質輕度不均，線粒體輕度腫脹，微絲數量略減少（圖2D）。

圖1 視網膜光鏡照片（HE染色×400）。圖1A為空白對照組，視網膜RGC排列整齊，邊界清楚，神經纖維層結構清晰。圖1B為模型對照組，視網膜RGC腫脹，神經纖維層顯著水腫。圖1C為生理鹽水組，視網膜大量RGC明顯腫脹，變性脫落，數量顯著減少，神經纖維層顯著變薄。圖1D為中藥治療組，視網膜少量RGC輕度腫脹，數量略減少，神經纖維層輕度變薄。

圖2 視網膜透射電鏡照片（醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色×20000）。圖2A為空白對照組，RGC胞體可見較長的突起，細胞核明顯，核膜清晰，染色均勻，線粒體豐富；圖2B為模型對照組，RGC胞體變形，細胞核腫脹明顯，線粒體腫脹；圖2C為生理鹽水組，RGC胞體變形，核皺縮，染色質邊聚，線粒體空泡化；圖2D為中藥治療組，少量RGC變性，細胞核可見，線粒體輕度腫脹。

3 討論

視神經萎縮不是一種單純的眼科疾病，是各種病因累及RGC及其軸突等損害后造成視神經纖維變性喪失的最終結局。當視神經受損時，神經纖維會出現部分變細或者全部變細的形態學改變。外傷性視神經損傷引起視功能損害主要為視神經血流灌注不良而缺血，導致RGC細胞凋亡，軸突數量減少，視神經軸索運輸受阻，導致神經纖維受損，甚至萎縮。

視神經萎縮一度被認為是視神經嚴重損傷的最終結局，近年的研究改變了這種認識，有研究顯示采用適當而積極治療對視神經萎縮的視功能可以起到一定的改善作用，并提出了殘余視覺激活理論[6]。對視神經萎縮的治療，中西醫均進行了較為廣泛的探索。相關實驗證明[7]，受損的軸突在某些條件下，可得到一定程度的修復，從而促進神經纖維的再生?？紫槊返萚8]通過實驗觀察了甲鈷胺治療視神經鉗夾傷后SD大鼠，光鏡和電鏡下可見視神經軸突和RGC異形改變明顯減少，能有效減少視神經的退變及喪失。鄭幼平等[9]用銀杏內脂B對視神經鉗夾傷后大鼠進行腹腔注射，結果顯示其能有效改善視神經鉗夾傷后RGC存活數量和存活時間，具有一定的視神經保護作用。徐朝偉等[10]以明目復元湯聯合中藥穴位貼敷治療急性視神經萎縮，結果顯示顯效及總有效率優于口服肌苷片、腺苷鈷胺片及維生素B12者。

由于治療視神經萎縮目前尚無確切有效療法，本研究以中醫理論為基礎，結合現代對外傷性視神經損傷的認識，即主要為視神經血流灌注不良而缺血，導致視網膜神經節細胞凋亡引發視神經萎縮的發病機制，提出目絡瘀阻，目系（指視神經及其周圍血管組織）失養的立法依據。針對外傷性視神經損傷有“血虧滯”的關鍵環節，采用治血一要養，二要行的指導原則。故本研究選用臨床有效治療視神經萎縮，以養血行血為法組成的雙芍護睛方制成散劑，用于實驗性外傷性視神經損傷模型，通過對視網膜神經組織形態學觀察以證實養血行血方對外傷性視神經損傷的作用。研究結果顯示，大鼠造模后大量RGC腫脹變形，胞核腫脹明顯，線粒體腫脹，神經纖維層顯著水腫；應用生理鹽水者大量RGC胞體變形，呈空泡樣變性脫落，數量顯著減少，核皺縮，神經纖維層顯著變??；而中藥治療組只有少量輕度腫脹，少量變性，數量略減少，細胞核可見，線粒體輕度腫脹，神經纖維層輕度變薄。提示養血行血方有抗RGC損傷，降低其凋亡，促進視神經纖維修復從而保護視神經的作用。本研究的不足之處是只作了定性觀察，未作視網膜神經節細胞數目等量化指標方面的檢測，希望在以后的實驗中能同時進行定性和定量的觀察。

[1]張曉君.進一步提高視神經萎縮的診斷水平[J].眼科，2011，20（6）：364-366.

[2]Dahlmann-Noor A H，Vijay S，Limb G A，et al.Strategies for optic nerve rescue and regeneration in glaucoma and other optic neuropathies[J].Drug discovery today，2010，15（7）：287-299.

[3]滕克禹，呂麗萍.視神經萎縮病因分析[J].中國中醫眼科雜志，2013，23（6）：428-430.

[4]李云琴.大鼠外傷性視神經損傷模型的建立[J].眼科新進展，2011，31（10）：934-936.

[5]徐叔云.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，2010：302-303.

[6]魏世輝，張秀蘭.正確認識視神經萎縮的治療價值[J].中華眼科雜志，2012，48（12）：1057-1058.

[7]張世杰，王傳富，孫為榮，等.視神經挫傷軸漿運輸和超微結構變化的實驗研究[J].眼科研究，2003，21（6）：585-587.

[8]孔祥梅，孫興懷.甲鈷胺對鉗夾大鼠視神經的保護作用[J].眼視光學雜志，2004，9（6）：157-164.

[9]鄭幼平，吳小桃，田原，等.銀杏內酯B對視神經鉗夾傷后大鼠視網膜神經節細胞的保護作用[J].中國醫學創新，2015，7（12）：13-15.

[10]徐朝偉，潘小玲.明目復元湯聯合中藥穴位貼敷治療急性視神經萎縮的臨床觀察[J].中國中醫急癥，2016，25（2）：309-311.

Morphological observation on experimental traumatic optic nerve injury managed by blood-nourishing and circulation-boosting formula

XIAO Jiaxiang，WEN Ting，YAO Ying.
Guizhou Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

OBJECTIVE To observe the morphological changes of protecting effect of blood-nourishing and circulation-boosting formula on experimental traumatic optic nerve injury.METHODS Sixty experimental SD rats were used in this study，and they were randomly and evenly divided into blank control group，model control group，saline group and TCM treatment group（15 cases，30 eyes in each group）.Observed the morphological change of optic nerve tissue in blank control group and the model control group 24 hours after modeling.While changes in the other two groups were observed 4 weeks after administration of saline and blood-nourishing and circulation-boosting formula respectively using left eye tissue.RESULTS After modeling，a large number of retinal ganglion cells（RGC）were in swollen，nuclei were swollen obviously and nerve fiber layers were in edema.In saline group，large scale of RGC deformed in vacuolar degeneration and decrease in the number，nuclear shrunk and nerve fiber layer thinned markedly；while in TCM treatment group，there was only a small amount of slight swelling RGC，mild degeneration，slight decrease in number and the nuclei were intact，nerve fiber layers were mildly thin.CONCLUSIONS The blood-nourishing and circulation-boosting formula prevented RGC from experimental injury，inhibited its apoptosis，and preserved optical nerve through promoting the retinal ganglion cells repairment.

blood-nourishing and circulation-boosting formula；optic nerve/injury；model of disease；animal

R285.5；R779.1

A

1002-4379（2017）01-0011-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.01.003

貴州省社發攻關項目（20123087）

貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴陽550001

肖家翔，E-mail：kate-show@163.com