CpG位點選擇對焦磷酸測序法檢測肝癌SMP30啟動子甲基化的影響

莫之婧，鄭順心，周素芳

(廣西醫科大學，南寧530021)

·論著·

CpG位點選擇對焦磷酸測序法檢測肝癌SMP30啟動子甲基化的影響

莫之婧，鄭順心，周素芳

(廣西醫科大學，南寧530021)

目的 選擇適宜的CpG位點用于焦磷酸測序法檢測肝癌衰老標記蛋白30(SMP30)啟動子甲基化。方法 提取人肝癌細胞系SMCC-7721和BEL-7404的基因組DNA，設計針對SMP30基因序列1和序列2的擴增和測序引物，焦磷酸測序法檢測SMP30基因序列1和序列2中的CpG位點甲基化程度，并用Sanger測序法驗證序列2中出現的SNP位點。結果 SMCC-7721和BEL-7404細胞系中，SMP30基因序列1中6個CpG位點低甲基化，與SMP30基因低表達不符，且測序結果質量評估均為失敗。SMP30基因序列2中6個CpG位點高甲基化，與SMP30基因低表達相符，前2個CpG位點均為通過，而后4個CpG位點均為失敗。去除第5和第6個CpG位點，只檢測SMP30基因序列2中poly(T)結構前4個CpG位點，SMCC-7721細胞系中甲基化程度分別為100%、90%、100%和80%；BEL-7404細胞系中甲基化程度分別為100%、92%、100%和77%。除第3個CpG位點為失敗，其余CpG位點均為通過。Sanger測序顯示SMCC-7721和BEL-7404細胞系在第3個CpG位點前存在SNP位點，且均為A。結論 焦磷酸測序時選擇靠近基因轉錄起始點上游且在poly (T)結構之前的CpG位點，測得的SMP30啟動子甲基化值較準確。

肝癌；衰老標記蛋白30;甲基化；焦磷酸測序

DNA甲基化是常見的表觀遺傳學修飾方式，在基因表達調控中發揮重要作用[1]。DNA甲基化的定量測定在病理情況下有重要意義[2]，檢測腫瘤相關基因的甲基化水平對腫瘤發生機制的闡明、腫瘤早期診斷和治療有重要意義[3]。衰老標記蛋白30(SMP30)是肝癌相關抗原之一[4]。本課題組通過使用特異siRNA抑制人肝癌HepG2細胞內SMP30表達，發現細胞的增殖和侵襲能力增強[5]。研究發現肝癌癌旁組織中SMP30 mRNA和蛋白質表達水平均升高，而在癌灶組織中表達水平均降低[6]。研究[7～9]表明，高頻率的抑癌基因啟動子區域甲基化在肝細胞癌(HCC)是一普遍的、早期事件。SMP30在肝癌組織中表達水平下降現象可能是DNA甲基化發揮作用的結果。焦磷酸測序法采用的是邊合成邊測序的方法，摻入核苷酸后釋放的焦磷酸可生成等量的ATP，ATP經酶轉化成相應比例的光信號，根據加入的核苷酸類型和測得的光信號強度可實時記錄模板DNA的核苷酸序列[10]。用焦磷酸測序法分析DNA甲基化模式，只需經簡單反應，就能獲得若干個CpG位點的精確甲基化值，且重復性好[11]。然而，在應用焦磷酸測序法進行甲基化測定時，常因CpG位點的選擇不當或序列存在poly (T) 結構和單核苷酸多態性(SNP)位點，無法得到高質量的測序結果。2014年9月,本研究以SMP30基因CpG島為研究對象，采用焦磷酸測序法檢測其甲基化狀況，研究上述情況下對DNA甲基化測定的影響，并優化檢測方法，以獲得準確可靠的SMP30啟動子甲基化檢查結果，為進一步研究甲基化水平與腫瘤發生的關系奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SMCC-7721和BEL-7404細胞系購自復旦IBS細胞資源中心。用含10%胎牛血清(Gbico公司)的高糖DMEM培養液(Gbico公司)，置于37 ℃、5%CO2條件下培養。臺式高速離心機(Thermo公司)；BIO RAD POWER PAC 3000(BIO RAD公司)；BIO RAD DNA SUB CELL(BIO RAD公司)；ABI 9700 PCR 擴增儀(Applied Biosystems公司)；NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度計(Thermo公司)；凝膠成像系統 GIS-1600(上海天能公司)；PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀(Qiagen公司)。

1.2 SMCC-7721和BEL-7404細胞系中SMP30基因表達檢測 細胞系總RNA提取使用RNA提取試劑盒(Omega公司)，按照RT-PCR試劑盒(Takara)說明書逆轉錄為cDNA。SMP30基因熒光定量PCR上游引物:5′-GTGGATGCCTTTGACTATGACC-3′，下游引物:5′-CTTCCCCTCAGCATCAATACAC-3′；GAPDH為內參，上游引物:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。反應體系為20 μL，其中cDNA 2 μL，引物0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL和ROX 0.4 μL，加超純水補齊至20 μL。

1.3 SMP30啟動子甲基化檢測方法 在UCSC Genome Browser(http://www.genome.ucsc.edu/)上查找SMP30基因的CpG島序列，其CpG島位于chrX:46937632-46938149，長度為518個堿基，含45個CpG位點。下游引物5′端由生物素修飾。序列1：上游引物:5′-TTGTTAGGGGAGGTTTTGTAGGATT-3′，下游引物:5′-ACTTAACAAATAAATAACATAAACCTAAA-3′，測序引物:5′-GGGAGGTTTTGTAGGATTTT-3′；序列2：上游引物:5′-GGGGAGGGGTTTTAGGTTTATGT-3′，下游引物:5′-ATCTCCTTCTAACAATCAACTATCA-3′，測序引物:5′-GGGTTTTAGGTTTATGTTATTTAT-3′。細胞系DNA提取按DNA提取試劑盒(Axygen)說明書進行，然后按照甲基化修飾試劑盒(Qiagen)說明書對基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，使DNA中的無甲基化修飾的C轉化為U，然后通過PCR擴增轉化為T。焦磷酸測序：PCR反應體系為50 μL，其中模板2 μL，5×buffer GC 10 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，dNTP(10 mmol/L) 1 μL,上下游引物各1 μL，加超純水補齊至50 μL。焦磷酸測序模板擴增反應條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s， 54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 7 min。

1.4 序列1甲基化程度檢測 選擇SMP30基因轉錄起始點上游序列1的6個CpG位點,焦磷酸測序法檢測甲基化程度。

1.5 序列2甲基化程度檢測 選擇SMP30基因轉錄起始點上游序列2的6個CpG位點檢測甲基化程度。當只檢測序列2中前4個CpG位點甲基化值時，用焦磷酸測序儀自帶軟件 PyroMark Assay Design編輯程序時，選擇不分析后2個CpG位點甲基化值。

1.6 SNP位點Sanger測序方法 樣品總DNA送北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger測序。

2 結果

2.1 SMCC-7721和BEL-7404細胞系中SMP30基因表達水平 SMP30基因在SMCC-7721和BEL-7404細胞系中均呈低表達(表1)。

2.2 序列1甲基化程度檢測結果 SMCC-7721細胞系6個CpG位點甲基化程度分別為39.61%、16.94%、18.23%、17.83%、19.62%和12.29%；BEL-7404細胞系6個CpG位點甲基化程度分別為42.02%、17.84%、19.67%、20.22%、23.73%和16.74%(圖1)。甲基化程度不高，與SMP30基因在兩種細胞系中低表達不符，序列1的6個CpG位點未能顯示甲基化與基因表達量的負相關性，且測序結果質量評估均為失敗。

表1 SMP30基因在SMCC-7721和BEL-7404細胞系中表達(±s)

圖1 CpG位點示意圖和熱解圖

2.3 序列2甲基化程度檢測結果 SMCC-7721細胞系 6個CpG位點甲基化程度分別為100%、100%、100%、84.64%、100%和100%，測序結果質量評估顯示前2個CpG位點為通過，后4個CpG位點為失??；BEL-7404細胞系6個CpG位點甲基化程度分別為100%、100%、100%、74.31%、100%和100%(圖2A)。測序結果的質量評估顯示前2個CpG位點為通過，后4個CpG位點為失敗。兩種細胞系的SMP30基因CpG位點均為高甲基化，與SMP30基因的低表達相符。第4個和第5個CpG位點之間有一段序列CGTTTCCCCTCCCCTCG經亞硫酸鹽修飾轉化后，無甲基化修飾的C會轉變為T，序列轉變為CGTTTTTTTTTTTTTCG，形成poly (T) 結構(圖2B)，影響了測序質量評估。

圖2 熱解圖和poly (T)結構圖

SMCC-7721細胞系前4個CpG位點的甲基化程度分別為100%、90%、100%和80%(均值為92.5%)；BEL-7404細胞系前4個CpG位點甲基化程度分別為100%、92%、100%和77%(均值為92.25%)。見圖3。除第3個CpG位點為失敗，其余3個CpG位點均為通過。第3個CpG位點為失敗，提示該位點前某個位置可能存在SNP位點或突變，影響測序質量評估。

2.4 Sanger測序驗證結果 查詢NCBI顯示SMP30基因轉錄起始點上游序列2的第3個CpG位點前有SNP位點：rs3814905，此SNP位點位于chrX:47078300-47078300，等位基因頻率為A:15.232%(575/3775)；G:84.768%(3200/3775)，G>A/G。采用焦磷酸測序法檢測此序列時，我們默認此SNP位點為G。為驗證是否此SNP位點對焦磷酸測序法的質量評估有影響，我們采用經典的Sanger測序法對SMCC-7721和BEL-7404細胞系中此序列進行測序。結果顯示SMCC-7721和BEL-7404細胞系此SNP位點均為A。

3 討論

基因CpG島的甲基化會顯著降低甚至完全沉默此基因的表達，基因CpG島的甲基化涉及多個CpG位點，不同CpG位點甲基化狀態對基因表達的調控作用不同[12]。SMP30基因的CpG島有45個CpG位點，焦磷酸測序法1次僅能檢測50～100 bp長度的序列，因此選擇合適的CpG位點尤其重要。

圖3 序列2前4個CpG位點焦磷酸測序熱解圖

序列2中6個CpG位點相比序列1更接近SMP30基因的轉錄起始點，從檢測結果看其高甲基化狀態更能體現對SMP30基因低表達的調控。

焦磷酸測序時，亞硫酸鹽修飾后的DNA序列中無甲基化修飾的C會轉變為U，經PCR擴增轉化為T，因此在富含CT的區域可能會形成poly (T)結構，峰高不能達到預期值，從而質量評估失敗。序列2中的第4和第5個CpG位點間存在poly (T)結構，共有13個連續的T，峰高不可能達到13個T的高度，從而影響了poly (T)結構前后的CpG位點甲基化質量評估，測序質量不佳。為了獲得高質量的檢測結果，我們選擇焦磷酸測序時只測poly (T)結構前面4個CpG位點，再次測序時質量明顯上升，poly (T)結構前的第4個CpG位點質量評估由之前的失敗轉變為通過?？梢?，在焦磷酸測序時，如遇poly (T)結構，可只測poly (T)結構前的序列，提高測序質量。在消除poly (T)結構的影響后，序列2前4個CpG位點甲基化檢測結果中，第3個CpG位點質量評估仍為失敗，表明第3個CpG位點以前某個位置可能存在突變或SNP位點，使峰高與預期峰不符，影響了測序質量。為驗證我們的判斷，采用經典的Sanger測序法，將測得的序列與NCBI中查得的對應基因片段序列比對，發現確實在第3個CpG位點前有SNP位點：rs3814905，等位基因頻率G>A/G，我們預期的位點為G，Sanger測序結果表明實際位點為A，從而峰高與預期峰高不符，測序質量的判斷是軟件分析位點前后的峰高判定的，所以當待測序列與理論峰高不一致時會影響測序質量的判定。而測序位點的甲基化比率是由C的峰高決定的，因此第3個CpG位點的甲基化值是可信的。

綜上所述，在用焦磷酸測序法檢測SMP30基因甲基化狀態時，我們選擇了靠近基因轉錄起始位點上游的CpG位點，除去了poly (T)結構的影響，并驗證了第3個CpG位點的甲基化質量評估失敗是由SNP位點引起的，不影響第3個CpG位點甲基化值的準確性，表明在肝癌細胞系中檢測到的SMP30啟動子高甲基化現象準確可信。

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Effect of CpG site selection on SMP30 promoter methylation detection in hepatocellular carcinoma by pyrosequencing

MOZhijing,ZHENGShunxin,ZHOUSufang

(GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To determine appropriate CpG sites for senescence marker protein 30 (SMP30) promoter methylation detection in hepatocellular carcinoma using pyrosequencing. Methods Genomic DNA was isolated from human hepatocellular carcinoma cell lines SMCC-7721 and BEL-7404. The amplification and sequencing primers were designed for SMP30 gene sequence 1 and sequence 2, and the methylation status of CpG sites in SMP30 gene sequence 1 and sequence 2 was determined by pyrosequencing technology. Sanger sequencing was used to validate the SNP. Results In SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines, the 6 CpG sites in SMP30 gene sequence 1 were low methylatied, which was not consistent with the low expression of SMP30 gene, and the quality of the sequencing results all failed. The 6 CpG sites in the SMP30 gene sequence 2 were highly methylated, which was consistent with the low expression of SMP30 gene, the first 2 CpG sites passed, and the last 4 CpG sites failed. The 5th and 6th CpG sites were ignored and only the first 4 CpG sites before the poly (T) structure in SMP30 gene sequence 2 were detected, the percentage of methylation in BCC-7721 cell line was 100%, 90%, 100% and 80%. The percentage of methylation in BEL-7404 cell line was 100%, 92%, 100% and 77%. Except for the 3th CpG site, the rest of the CpG sites passed. Sanger sequencing showed that SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines had SNP sites before the 3th CpG site, and all of them were A. Conclusion Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites near the upstream of transcription start site and before the poly (T) structure in SMP30 promoter is more accurate.

liver carcinoma; senescence marker protein 30; methylation; pyrosequencing

國家自然科學基金委員會資助項目(81460432)。

莫之婧(1981-)，女，碩士，主要研究方向為疾病的分子生物學。E-mail:36456198@qq.com

周素芳(1964-)，女，博士研究生，教授，主要研究方向為腫瘤抗原分子生物學。E-mail:zsf200000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.001

R735.7

A

1002-266X(2017)09-0001-04

2016-11-19)