微小RNA-200c靶向抑制EFNA1基因對胃癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響

李鷹飛，高健偉，王紅，周永健，聶玉強

(廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院,廣州 510180)

微小RNA-200c靶向抑制EFNA1基因對胃癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響

李鷹飛，高健偉，王紅，周永健，聶玉強

(廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院,廣州 510180)

目的 探討微小RNA(miR)-200c靶向抑制肝配蛋白A1(EFNA1)基因對胃癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 選取胃癌細胞株SGC7901，隨機分為miR-200c模擬物組、模擬物對照組、miR-200c抑制物組、抑制物對照組，分別轉染miR-200c模擬物、模擬物對照寡核苷酸、miR-200c抑制物、抑制物對照寡核苷酸，采用CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell法檢測細胞侵襲。采用雙熒光素酶實驗驗證miR-200c對EFNA1基因的靶向抑制作用。取本院手術切除的胃癌和相應癌旁組織標本48例份，通過免疫組化法檢測EFNA1蛋白表達，分析胃癌組織中EFNA1蛋白表達與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、病理類型、浸潤深度、淋巴結及遠處轉移、腫瘤部位間的關系。結果 與模擬物對照組相比，miR-200c模擬物組胃癌細胞SGC7901增殖活性降低(P<0.05)，總凋亡率升高(P<0.05)，侵襲能力降低(P<0.05)。miR-200c模擬物組的熒光素酶活性低于模擬物對照組(P<0.05)，而miR-200c抑制物組的熒光素酶活性高于抑制物對照組(P<0.05)。EFNA1蛋白在胃癌組織中表達高于癌旁組織，其高表達與胃癌淋巴結轉移有關(P<0.05)，與其他臨床病理特征均不相關(P均>0.05)。結論 胃癌組織中EFNA1基因呈高表達，miR-200c可通過靶向EFNA1基因抑制胃癌細胞增殖及侵襲，促進凋亡。

胃癌；微小RNA-200c；肝配蛋白A1；細胞增殖；侵襲

Effect of Micro-200c on cell proliferation, apoptosis and invasion of

癌癥研究機構近年數據顯示，胃癌的發病率居全球惡性腫瘤的第5位，病死率高居第3位[1]，而我國每年胃癌新發病例占世界新發病例40%以上。我們前期研究發現，miR-200c在胃癌中呈高表達[2]，但受其直接調控的下游基因表達情況尚不明確。通過TargetScan、miRanda、Diana、Pitar等多個miRNA靶基因預測軟件均預測了miR-200c與EFNA1結合，miR-200c靶位點在各物種間保守性強，所結合的雙鏈具有極強的熱穩定性，miR-200c靶位點鄰近終止密碼子，但離終止密碼子多于15 nt，此類結合位點更具有活性[3]。EFNA1基因可能是miR-200c的靶基因。盡管近年來研究發現EFNA1與多種腫瘤的血管生成及侵襲轉移有關[4]，但在胃癌中的研究甚少。2016年1～4月，我們探討了miR-200c靶向抑制EFNA1基因對胃癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株SGC7901為本實驗室保存。RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；聚合酶鏈反應試劑盒、雙熒光素酶報告系統(Promega公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(Invitrogen公司)；miR-200c模擬物、miR-200c抑制物、對照寡核苷酸(廣州銳博生物公司)；兔抗人EFNA1多克隆抗體(Santa Cruz公司)；山羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；凋亡檢測試劑盒、Matrigel膠(BD公司)；CCK8試劑(碧云天生物技術公司)。48例胃癌組織標本取自2006年1月～2008年12月于廣州市第一人民醫院切除的胃腺癌組織標本，癌旁組織取自同一患者距癌灶5 cm以上的組織?；颊咝g前均未接受放化療治療。根據美國癌癥聯合會第7版的胃癌TNM分期標準，依據病理及影像學檢測對胃癌進行分期。收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、吸煙、飲酒、病理類型、浸潤深度、淋巴結及遠處轉移、腫瘤部位等指標。本研究獲廣州市第一人民醫院臨床醫學倫理委員會的批準，入選患者均知情同意。

1.2 細胞培養、分組及轉染 將人胃癌細胞SGC7901培養于含10%胎牛血清的1640培養基中，37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞處于對數生長期時進行后續實驗。將SGC7901細胞密度調整至2×105/mL，接種于6孔板中，將細胞隨機分為miR-200c模擬物組、模擬物對照組、miR-200c抑制物組、抑制物對照組，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-200c模擬物(50 nmol/L)、模擬物對照寡核苷酸(50 nmol/L)、miR-200c抑制物(100 nmol/L)、抑制物對照寡核苷酸(100 nmol/L)，每組設3個復孔，轉染后將細胞置于恒溫培養箱中繼續培養48 h進行后續實驗。

1.3 載體構建及熒光素酶活性檢測 以健康人外周血DNA為模板，克隆EFNA1 3′非翻譯區(UTR) (836 nt)上游引物:5′-CCGCTCGAGATGCCACACCTGGCCTTAAAG-3′，下游引物：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAGCAGGGACTCAATGGTCATATG-3′，EFNA1 PCR產物回收。將PCR產物(EFNA1)及載體(psiCHECK-2)用XhoⅠ與NotⅠ雙酶切，酶切后目的片段及載體經T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，質粒酶切鑒定陽性克隆，挑取陽性菌落進行測序。胃癌SGC7901細胞以2×104/孔種植于24孔板中，將psiCHECK2：EFNA1 3′UTR質粒和miR-200c模擬物/抑制物共轉染細胞，采用Promega公司的Dual Luciferase Reporter Assay System進行樣品的熒光素酶活性檢測，以空白質粒作為對照,每組實驗重復3次。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。收集對數生長期的胃癌細胞SGC7901，分為miR-200c模擬物組、模擬物對照組，將細胞濃度調至3.0×103/mL，接種于無菌96孔培養板內，各設3個復孔。連續檢測5 d，檢測時每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃繼續孵育3 h，用酶聯免疫檢測儀以450 nm波長測定光密度(OD)值，繪制細胞生長曲線。

1.5 細胞凋亡檢測 采用凋亡試劑盒Annexin V/碘化丙錠，將miR-200c模擬物組、模擬物對照組細胞分別加入Annexin V 5 μL 和碘化丙啶1 μL染色，混勻避光室溫孵育15 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 細胞體外侵襲能力檢測 將miR-200c模擬物組、模擬物對照組細胞分別接種于含Matrigel膠的Transwell小室，每組設3個復孔。37 ℃、5%CO2孵育24 h取出小室，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色10 min，PBS洗滌。100倍顯微鏡下隨機計數5個視野細胞數，取每組穿過小室細胞數的平均數。

1.7 胃癌及癌旁組織中EFNA1蛋白表達檢測 取已包埋好的石蠟切片至4 μm厚，常規脫蠟、水洗后，采用Tris-EDTA(pH 9.0) 高壓熱修復法，4 ℃兔抗人EFNA1多克隆抗體(1∶125)孵育過夜，PBS洗滌，山羊抗兔二抗37 ℃孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水干燥后中性樹膠封固。每例鏡下隨機采集10個視野，以鏡下陽性細胞百分比和染色強度給予評分。無陽性細胞為0分，陽性細胞≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者計分相加即陽性等級：0分為-，1～3分為±，4～5分為+，6～7分為++。

2 結果

2.1 EFNA1 3′UTR質粒構建情況及熒光素酶活性比較 用PCR法從健康人外周血DNA擴增EFNA1 3′ UTR，可見目地片段克隆成功(836 bp)。隨機挑選2個psiCHECK2:EFNA1 3′UTR重組質粒進行酶切鑒定，可見酶切產物為目的片段，可送檢相應質粒測序鑒定。測序結果鑒定證實psiCHECK2:EFNA1 3′UTR質粒構建成功，可用于后續雙熒光素酶實驗。雙熒光素酶實驗表明，miR-200c模擬物組、模擬物對照組的熒光素酶活性分別為0.91±0.01、1.08±0.01，兩組比較，P<0.01；miR-200c抑制物組、抑制物對照組的熒光素酶活性分別為1.01±0.01、0.94±0.02，兩組比較，P<0.05。

2.2 miR-200c對胃癌細胞增殖的影響 轉染miR-200c模擬物后第5天時，胃癌細胞SGC7901 OD值(1.19±0.12)較轉染模擬物對照寡核苷酸(1.52±0.09)降低(P<0.05)，提示miR-200c可抑制胃癌細胞的增殖活性，見圖1。

圖1 miR-200c模擬物組、模擬物對照組細胞的生長曲線

2.3 miR-200c對胃癌細胞凋亡的影響 miR-200c模擬物組、模擬物對照組細胞總凋亡率分別為(5.82±0.33)%、(3.54±0.28)%，兩組比較，P<0.01，提示miR-200c可促進胃癌細胞凋亡。

2.4 miR-200c對胃癌細胞侵襲的影響 Transwell實驗表明，miR-200c模擬物組、模擬物對照組穿過濾膜的細胞數分別為(51.00±5.57)、(85.67±4.04)個/視野，兩組比較，P<0.01，提示miR-200c能抑制胃癌細胞的侵襲。

2.5 EFNA1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達比較 免疫組化結果顯示EFNA1蛋白均在上皮細胞的胞質染色表達。胃癌組織中EFNA1蛋白表達-者5例，±者12例，+者16例，++者15例，癌旁組織中-者12例，±者18例，+者13例，++者5例，Wilcoxon秩和檢驗分析表明胃癌組織較癌旁組織EFNA1蛋白表達量升高(P<0.01)。進一步分析發現，EFNA1蛋白高表達與胃癌淋巴結轉移有關(P=0.03)，但與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、病理學類型、浸潤深度、遠處轉移及腫瘤部位等指標無顯著關系(P均>0.05)，見表1。

表1 EFNA1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

MicroRNAs是長22 nt的非編碼RNA，可通過其“種子區域”(miRNA 5′端第2～7個核苷酸)與靶mRNA 3′UTR堿基互補，并在RNA誘導的沉默復合體作用下，完全的堿基互補可降解mRNA，不完全的互補可抑制mRNA表達，從而調節細胞的多種生物學功能，包括時序性發育、分化、增殖和凋亡等生命過程，并參與腫瘤的發生發展[5]。

miR-200c是腫瘤上皮間充質轉化(EMT)進程中重要的調節因子，可抑制腫瘤細胞EMT及浸潤轉移。miR-200c能直接靶向抑制轉錄因子ZEB1和ZEB2，使E-cadherin表達上調，進而阻止EMT進程，抑制腫瘤侵襲和轉移[6]。miR-200c還能改善化療或放療對腫瘤細胞的敏感性。Shi等[7]發現miR-200c能靶向抑制VEGFR2表達，增加肺癌細胞系A549對放療的敏感性。Tang等[8]發現miR-200c能靶向抑制胃癌DNMT3A、DNMT3B及轉錄因子SP1的表達，導致全基因組范圍內低甲基化及p16、E-cadherin等抑癌基因的重新表達，從而起到抑癌作用。miR-200c還在調節腫瘤干細胞的生物行為學過程中發揮核心作用[9]。盡管如此，miR-200c調控胃癌侵襲轉移所涉及的復雜網絡仍未完全闡明。本研究結果表明miR-200c能抑制EFNA1表達，這可能是miR-200c作用的新靶點。

EFNA1是糖基磷脂酰肌醇偶聯配體，有205個氨基酸，其與酪氨酸激酶受體EphA2的胞外配體結合區相結合，激活酪氨酸磷酸酶而活化，導致自身磷酸化及下游大量胞內底物蛋白分子的酪氨酸磷酸化，啟動不同的信號傳導途徑，從而引起一系列生物學效應，參與細胞的生長、遷移和分化活動，并在腫瘤形成等方面發揮重要作用[10]。EFNA1及其受體是血管生成的重要信號分子之一。Matthias等[11]研究發現，EFNA1與其受體EphA2結合后，可激活低氧誘導因子-1和血管內皮生長因子表達，使得腫瘤血管大量生長，提高腫瘤的侵襲性，并在結腸癌、前列腺癌及卵巢癌等多種實體腫瘤中發現這一機制的存在[12]。下調EFNA1表達能減少腫瘤誘導的內皮細胞遷移和微血管形成，而EFNA1高表達則能增強內皮細胞遷移活性[13]。目前關于EFNA1和胃癌的研究尚不多見，主要見于胃癌組織中EFNA1蛋白的表達研究。Nakamura等[14,15]研究表明有57%和72.7%的胃癌組織高表達EFNA1蛋白，同時EFNA1表達與TNM分期和淋巴結轉移相關。提示EFNA1在腫瘤的血管生成、黏附侵襲和轉移過程中有促進作用。本研究結果證實，胃癌組織中EFNA1高表達可促進胃癌淋巴結轉移，此與之前研究相符。

綜上所述，miR-200c在胃癌細胞中可起到抑癌基因的作用，miR-200c通過靶向抑制EFNA1表達，對胃癌增殖和侵襲進行調控，有可能成為胃癌臨床生物治療的新靶點。鑒于目前尚無EFNA1與腫瘤EMT的報道，下步我們需明確EFNA1過表達是否引起胃癌EMT轉化，以及miR-200c逆轉胃癌EMT轉化過程中EFNA1所扮演的角色。

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gastric cancer by targeting EFNA1 gene

LIYingfei,GAOJianwei,WANGHong,ZHOUYongjian,NIEYuqiang

(GuangzhouFirstPeople'sHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

Objective To evaluate the effect of microRNA (miR)-200c on regulating cell proliferation, apoptosis and invasion by targeting ephrin A1 (EFNA1) in gastric cancer cells. Methods SGC7910 cells were cultivated and randomly divided into miR-200c mimics group and mimics control group, which were then transfected by miR-200c mimics and mimics oligonucleotides.Cell proliferation was detected by CCK-8, apoptosis was determined by flow cytometry, and cell invasion was assessed using Transwell assay. The target relationship between miR-200c and EFNA1 was measured by the dual luciferase reporter gene system. Cancer and adjacent non-cancerous tissues were obtained from 48 patients who underwent gastrectomy at Guangzhou First People's Hospital, and the protein expression of EFNA1 was tested by immunohistochemistry. The relationship between EFNA1 expression and gender, age, smoking status, alcohol drinking, histological type, depth of invasion, lymph node and liver metastasis was assessed. Results Compared with the mimics control group, the proliferative activity of SGC7910 cells in the miR-200c mimics group was decreased, the whole apoptosis rate was increased and the invasive ability was decreased (allP<0.05). The luminescence intensity was significantly decreased in miR-200c mimic transfected cells than in mimics control cells (P<0.05), and the luminescence intensity was significantly increased in miR-200c inhibitor transfected cells than in inhibitor control cells (P<0.05). EFNA1 was significantly up-regulated in the gastric cancer tissues as compared with that noted in the adjacent non-cancerous tissues. The high expression of EFNA1 was associated with lymph node metastasis (P<0.05), but not associated with other clinicopathological characteristics (allP>0.05). Conclusion EFNA1 gene was highly expressed in the gastric cancer. miR-200c can inhibit gastric cancer cell proliferation and invasion, and enhance cell apoptosis by targeting EFNA1 gene.

gastric carcinoma; micro RNA-200c; ephrin A1; cell proliferation; invasion

國家自然科學基金資助項目(81502040)；廣州市衛生和計劃生育科技一般引導項目(20161A010009)。

李鷹飛(1982-)，男，主治醫師，主要研究方向為胃癌發病機制研究。E-mail：liyingfei304@163.com

聶玉強(1961-)，男，主任醫師，教授，主要研究方向為消化道腫瘤發病機制研究。E-mail：nieyuqiang1@21cn.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.005

R735.2

A

1002-266X(2017)09-0016-04

2016-12-21)