肝激酶B1過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖及轉移的影響

黃志強，曹文斌，葛志鵬，田煒，張琪，程文煒，張國志

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2華北理工大學醫學實驗中心；3中南大學公共衛生學院)

肝激酶B1過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖及轉移的影響

黃志強1，曹文斌1，葛志鵬1，田煒2，張琪1，程文煒3，張國志1

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2華北理工大學醫學實驗中心；3中南大學公共衛生學院)

目的 探討肝激酶B1(LKB1)過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖及轉移的影響。方法 將培養好的甲狀腺乳頭狀癌K1細胞隨機分為空白組、陰性對照組和實驗組，將空載病毒、LKB1重組真核體分別轉染入陰性對照組、實驗組，空白組不做任何處理。RT-PCR技術檢測各組LKB1 mRNA表達，Western blotting法檢測細胞內LKB1蛋白表達，用MTT法檢測細胞增殖能力(OD值)，用Transwell侵襲試驗檢測細胞轉移能力，流式細胞術檢測細胞周期分布。結果 實驗組LKB1 mRNA、蛋白相對表達量高于陰性對照組、空白組(P均<0.05)。轉染72 h，繼續培養24、48、72、96 h實驗組OD值低于陰性對照組、空白組(P均<0.05)。轉染24 h，實驗組穿膜細胞數少于陰性對照組、空白組(P均<0.05)。轉染24 h，與陰性對照組、空白組比較，實驗組G0/G1期細胞增多，S期、G2/M期細胞減少(P均<0.05)。結論 LKB1過表達能抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖、轉移。

甲狀腺腫瘤；甲狀腺乳頭狀癌；肝激酶B1；細胞增殖；細胞轉移；細胞周期

肝激酶B1(LKB1)主要編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。最早在黑色素斑-胃腸多發性息肉綜合征(PJS)患者中發現該基因缺失[1]，該基因胚系突變是導致PJS的主要原因，亦是腫瘤發生的重要遺傳基礎。有研究證實，LKB1基因突變或失活與胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、非小細胞肺癌發生有關[2～5]。但有關LKB1與甲狀腺癌關系的研究較少。國內僅沈峰清等[6]報道了在甲狀腺乳頭狀癌細胞中LKB1低表達。2016年1～9月，本研究通過攜帶LKB1基因的慢病毒轉染甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，建立穩定表達外源性LKB1基因的細胞模型，以探討LKB1過表達對甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖及轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞(華北理工大學實驗中心)，RPMI1640培養基(Gibco公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)，LKB1慢病毒(上海亞載生物科技有限公司)，TRIpure(BioTeke公司)、逆轉錄試劑盒(GenStar公司)，聚合酶鏈反應試劑盒、LKB1引物(Invitrogen公司)，兔抗人LKB1多克隆抗體(Affinity公司)，HR標記山羊抗兔IgG二抗、GAPDH抗體、MTT細胞增殖及毒性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、DAB顯影液(上海碧云天生物技術研究所)，24孔Transwell小室(Corning公司)。RT-PCR儀(Gene Company Iimited公司)，酶標儀、濕轉系統(上海BIO-RAD公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細胞培養、分組及轉染 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養。取生長狀態良好的細胞用0.25%胰酶消化制成細胞懸液接種于6孔板中，將融合度達60%的細胞隨機分為空白組、陰性對照組和實驗組，空白組不做任何處理，將空載病毒、LKB1重組真核體分別轉染入陰性對照組、實驗組。轉染24 h后更換完全培養基，72 h后觀察熒光轉染率，轉染率大于80%的細胞備用。

1.3 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞內LKB1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術。轉染72 h，取各組細胞，按TRIpure說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量，取RNA 5 μg按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA后進行PCR擴增。LKB1上下游引物分別為5′-GCGATGCTTGAGTACGAACCG-3′、5′-AGTACGGCACCACAGTCATGCT-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環[7]。采用2-ΔΔCT法計算LKB1 mRNA 相對表達量。

1.4 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞內LKB1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。轉染72 h，提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白與2×蛋白上樣緩沖液按1∶1混勻，放入加熱器中100 ℃變性5 min，-80 ℃保存。配制10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白上樣40 μg后電泳。濕轉條件：300 mA，1.5 h。10%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(LKB1、GAPDH稀釋度均為1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽液洗膜10 min×3次，加入二抗(1∶1 000)室溫2 h，Tris-HCl緩沖鹽液洗膜10 min×3次，ECL熒光顯色。應用軟件Image J分析條帶灰度值。LKB1蛋白相對表達量=LKB1灰度值/GAPDH灰度值。

1.5 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖能力檢測 采用MTT法。轉染72 h，用0.25%胰酶消化各組細胞，制成單細胞懸液，按100 μL中2 000/孔接種于4個96孔板，每組設4個復孔，培養24、48、72、96 h各孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續培養箱中反應4 h，棄培養基，每孔加入二甲基亞砜100 μL，置于培養箱中反應15 min。用酶標儀在波長570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)。OD值與細胞數呈正比，用OD值表示細胞增殖能力。

1.6 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞轉移能力檢測 采用Transwell侵襲試驗。轉染72 h用0.25%胰酶消化，離心，用1%FBS培養基制成細胞懸液，按100 μL中2×105/孔將細胞懸液接種于Transwell小室的上室內，下室加入含20%FBS的1640培養基700 μL。置于37 ℃孵箱中繼續常規培養，24 h后取出小室，用棉簽輕輕擦去未穿膜的細胞，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定1 h，HE染色。每個膜隨機挑選5個視野，在倒置顯微鏡100倍鏡下計數各視野穿膜細胞數。實驗重復3次取平均值。

1.7 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞周期檢測 采用流式細胞術。轉染72 h，用0.25%胰酶消化各組細胞，待細胞長至70%時收集，用4 ℃預冷的70%乙醇固定24 h，核糖核酸酶37 ℃孵育30 min，加入碘化丙啶室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測，每標本檢測2×104個細胞，實驗重復3次。

2 結果

2.1 人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞中LKB1 mRNA、蛋白表達比較 實驗組、陰性對照組、空白組LKB1 mRNA相對表達量分別為5.992±0.610、1.065±0.198、1.013±0.060，LKB1蛋白相對表達量分別為1.152±0.042、0.343±0.049、0.339±0.021；實驗組LKB1 mRNA、蛋白相對表達量高于空白組、陰性對照組(P均<0.05)，陰性對照組與空白組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.2 LKB1過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖能力的影響 培養24、48、72、96 h實驗組OD值低于陰性對照組、空白組(P均<0.05)，陰性對照組與空白組比較,P均>0.05。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖能力比較(±s)

2.3 LKB1過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞轉移能力的影響 轉染72 h，實驗組、陰性對照組、空白組穿膜細胞數分別為(118±8)、(332±19)、(335±17)個/視野。實驗組穿膜細胞數少于空白組、陰性對照組(P均<0.05)，陰性對照組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 LKB1過表達對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞周期的影響 轉染72 h，與陰性對照組、空白組比較，實驗組G0/G1期細胞增多，S期、G2/M期細胞減少(P均<0.05)?？瞻捉M與陰性對照組細胞周期分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組不同周期細胞分布比較(%，±s)

3 討論

LKB1基因位于19p13.3，整個基因跨度23 kb，主要編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最早在PJS患者中發現[7]。PJS是一種LKB1基因突變的常染色體顯性遺傳疾病，主要表現為皮膚黏膜色素沉著、消化道多發性息肉且高度腫瘤傾向[8]。目前研究證實，LKB1基因缺失與胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、非小細胞肺癌的發生密切相關[2～5]。

增殖是腫瘤細胞重要生物學特征之一。He等[9]研究發現，通過NKX-2/p53通路改變，LKB1缺失促進大腸癌細胞惡性增殖及不良預后。梁璇等[10]研究發現，LKB1過表達能抑制肺腺癌細胞生長、增殖。Kan等[11]研究發現，LKB1過表達能抑制SW620細胞增殖和遷移[13]。本研究結果顯示，實驗組細胞增殖能力低于空白組和陰性對照組，說明過表達LKB1能抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖。

LKB1過表達通過促進p21的表達，使細胞阻滯于G1期[12]。LKB1缺失會上調周期蛋白D1(Cyclin D1)、CyclinE表達，加快細胞周期進展[16]。此外，研究發現，過表達LKB1的乳腺癌細胞可通過上調p21表達及下調CyclinD1、CyclinE表達，從而阻滯細胞周期進展[14]。本研究結果顯示，實驗組G0/G1期細胞百分比高于陰性對照組，S期細胞百分比低于陰性對照組，說明LKB1過表達能阻滯細胞周期從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。

轉移是腫瘤細胞另一重要生物學特征。研究發現，LKB1基因缺失可通過增強CyclinD1和下調環氧合酶-2促進腫瘤細胞轉移[13]。本研究結果顯示，與陰性對照組和空白組相比，實驗組穿膜細胞數減少，說明LKB1過表達能抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞轉移。

綜上所述，LKB1過表達能抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖、轉移。

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張國志(E-mail: 1462312868@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.011

R736.1

A

1002-266X(2017)09-0036-03

2016-09-11)